近年来，免疫肿瘤学研究方面的突破性进展带来了肿瘤攻击形式上的重大变革，其治疗效果表现优异，可以使以往实践表明手术、放疗、化疗和靶向治疗疗效欠佳的肿瘤发生持久性消退。以PD-1/PD-L1/CTLA-4等分子为代表的免疫检查点阻断（ICB）疗法是近年来免疫肿瘤学研究中的热门领域之一。
不过，目前的ICB治疗只对少数癌症患者有益。癌症抵抗和逃避免疫的两个主要机制是癌细胞表达抑制分子导致的T细胞功能障碍和MHC-I丢失导致的抗原呈递缺陷，即T细胞排斥。
通常，缺乏MHC-I的细胞，会被自然杀伤细胞(NK)识别并杀死。因此，疑问随之而来：为何MHC-I缺陷的肿瘤细胞不会被NK细胞杀死?
2024年4月23日，寻百会生物的联合创始人肖腾飞博士、刘小乐博士以及首席信息官胡熙浩博士作为共同通讯作者，在顶刊《Cell》上发表一篇名为《IGSF8 is an innate immune checkpoint and cancer immunotherapy target》的研究文章。（图1）
这项研究中，研究人员通过CRISPR筛选，发现肿瘤表达的IGSF8通过与NK细胞上的人KIR3DL2和小鼠Klra9受体相互作用来抑制NK细胞功能。IGSF8通常在神经元组织中表达，在体外或体内都不是细胞存活所必需的。在许多肿瘤中，会出现过表达并且与低抗原呈递、低免疫浸润和较差的临床结果相关。阻断IGSF8-NK受体相互作用的抗体在体外和体内均上调了NK细胞的杀伤作用。在同基因肿瘤模型中，抗IGSF8单独或与抗PD-1联合使用可以抑制肿瘤生长。研究结果表明，IGSF8是一种先天免疫检查点，可以作为治疗癌症的靶点。（图2）
研究人员用MHC-I高表达的COLO205人结肠癌细胞系和MHC-I缺乏的AGS人胃癌细胞系进行了NK细胞共培养CRISPR筛选，鉴定影响NK细胞介导的癌细胞杀伤的基因。
负选择基因是NK细胞的抑制基因，正选择基因是NK细胞的激活配体。除了预期的靶标外，IGSF8在两类细胞筛选中始终作为强负选择基因出现。IGSF8(也被称为EWI-2、CD316、LIR-D1)是免疫球蛋白超家族EWI亚家族的成员，但很少有发表的研究直接探究IGSF8的功能。来自DepMap项目的在基线条件下(没有免疫细胞)生长的数百种癌细胞系的CRISPR筛选表明，IGSF8对癌细胞存活没有重大影响。
为了验证恶性细胞中IGSF8缺失可以增强NK细胞杀伤力的假设，研究人员敲除癌细胞系中的IGSF8，观察到原代NK细胞的杀伤显著增加，结合其他癌细胞实验，表明IGSF8在不同类型的癌症中具有同样的抑制功能。通过敲除MHC-I成员B2M，发现没有改变IGSF8 mRNA或蛋白表达，表明IGSF8对NK细胞毒性的抑制可能是由MHC-I不相关的机制介导的。在共培养过程中的观察结果表明，IGSF8通过抑制脱颗粒来抑制NK细胞介导的细胞毒性。
由于IGSF8基因在人和小鼠之间的序列同源性，研究人员使用两种不同的CRISPR gRNAs敲除小鼠模型（B16-F10）中的IGSF8，同样观察到NK细胞杀伤显著增加。此外，IGSF8敲除在体外对B16-F10细胞生长影响不大，但在体内可显著降低C57BL/6同基因小鼠的肿瘤生长。流式细胞术检测肿瘤浸润的CD45+细胞显示，敲除B16-F10中的IGSF8导致NK和CD8 T细胞显著增加，对巨噬细胞的影响很小。RNA-seq图谱显示，IGSF8敲除导致肿瘤中NK细胞介导的细胞杀伤力显著上调，抗原加工和呈递增加，T细胞信号传导增加。以上研究结果表明，IGSF8是一个NK细胞检查点和新的免疫治疗靶点。（图3）
研究人员注意到，IGSF8蛋白通常与PBMC中的静息NK细胞存在弱相互作用，但在研究中的CRISPR筛选中使用的扩增NK细胞中，这种相互作用显着增强。
研究人员采用了两种不同的方法，以鉴定IGSF8在人NK细胞上的结合部位。首先比较两种细胞群体之间的RNA-seq谱，发现KIR3DL2是差异表达的高数量受体。其次进行CRISPR筛选，再次确定了KIR3DL2基因在NK细胞中的缺失会降低IGSF8与NK细胞的结合程度。（图4）
KIR3DL2是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)的一员，3D结构建模显示，IGSF8与人和小鼠MHC-I和B2M蛋白的alpha3结构域具有高度的结构相似性，证实IGSF8可以代替MHC-I/B2M与KIR3DL2结合。
研究人员用几种方法验证了KIR3DL2和IGSF8之间的特异性相互作用。包括但不限于测量亲和力、特异性抗体阻断测试以及高通量相互作用筛选等，证明了IGSF8和人类NK细胞上的KIR3DL2受体之间存在特异性相互作用。
接下来，研究人员试图评估IGSF8-KIR3DL2相互作用对NK细胞介导的细胞毒性的影响。一系列发现提供了IGSF8通过其与KIR3DL2的特异性相互作用抑制NK细胞介导的细胞杀伤力的证据。
在小鼠中Ly49家族的Klra9与人KIR3DL2功能相似，其mRNA在与小鼠IGSF8蛋白结合的NK细胞中明显更丰富，其蛋白与CT26-IGSF8细胞存在特异性结合。KIR3DL2和Klra9的镜像功能和遗传特征表明，它们与IGSF8的相互作用在调节NK细胞中起同样作用。（图5）
在癌症基因组图谱(TCGA)肿瘤谱中，IGSF8 mRNA在黑色素瘤中最为丰富，并且在许多实体肿瘤类型中显著过表达。不同细胞中的RNA 测序分析也证实，IGSF8在恶性细胞中表达最高。IGSF8 mRNA的表达与MHC-I成员B2M呈负相关。
对公开数据的调查表明，IGSF8 较高的肿瘤具有较差的免疫浸润、对细胞毒性的低易感性、抗原呈递缺陷以及抗PD1治疗的抗性。与其他实体肿瘤相比，肾癌具有不同的肿瘤免疫微环境和ICB反应特征，和IGSF8在肾癌中也与其他实体肿瘤不同，支持其作为免疫检查点的潜在作用。（图6）
研究人员进一步在蛋白质水平上进行验证，通过在多种肿瘤组织上进行免疫组化染色，观察到MHC-I和IGSF8蛋白在相同肿瘤样本中不同恶性细胞之间的异质性和反向表达。这一结果提示IGSF8在MHC-I缺乏的肿瘤中逃避NK细胞攻击的潜在作用。（图7）
研究人员结合IGSF8 mRNA表达与临床结果之间的关系，发现良好的抗原呈递和低IGSF8表达可能是抗PD1反应的信息预测或指标。
通过小鼠模型，研究人员推断通过抗体系统阻断IGSF8可能具有良好的耐受性。随之开发了一种针对IGSF8的高亲和力高特异性抗体(IGSF8.06)，以阻断IGSF8与其结合受体之间的相互作用。
在体外评估中，发现它可以显著增强扩增NK细胞对AGS和COLO205细胞的细胞毒性。该抗体还增加了PBMC来源的NK细胞对过表达IGSF8或HLA-C的K562细胞的杀伤力。
在组织模型中，再次观察到PBMC来源的NK细胞在IGSF8.06治疗后对这些恶性细胞的杀伤作用升高。
在小鼠模型中，IGSF8.06抗体显著增强表达Klra9的扩增小鼠脾源性NK细胞对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的细胞毒性。总之，这些结果表明，IGSF8.06抗体通过阻断IGSF8与其NK受体的相互作用来增强NK细胞对恶性细胞的杀伤力。
研究人员在B16-F10同基因肿瘤模型中检测了IGSF8.06抗体的体内疗效。在肿瘤生长抑制和小鼠存活率方面，可以观察到显著的体内疗效。研究结果表明，抗IGSF8的抗体阻断IGSF8与其NK受体之间的相互作用，激活先天免疫，促进抗原呈递，以NK细胞依赖的方式抑制肿瘤生长，并与抗PD1治疗具有叠加效应。
这项研究发现了IGSF8，这是一个以前未被发现的NK细胞检查点，在恶性细胞上高度表达以抑制NK细胞介导的细胞杀伤。
IGSF8是一个NK细胞检查点，IGSF8可能具有额外的癌细胞内在和外在功能。研究人员针对此发现开发了IGSF8.06抗体，专门针对在恶性细胞上表达的IGSF8，阻断IGSF8与NK细胞的相互作用。该抗体的独特之处在于，它刺激NK细胞杀死具有抗原呈递缺陷和应激信号的恶性细胞，而保留显示正常MHC - 1且没有应激信号的正常细胞。这种抗体也可能有助于防止最初对抗PD-1或抗PD-L1抗体有反应的肿瘤通过抗原呈递丢失而产生的耐药性。通过PD1/PD-L1双重靶向T细胞和通过IGSF8/KIR3DL2双重靶向NK细胞可能达到最佳疗效，并减少免疫治疗耐药的出现。
研究人员在文末提到：目前正在癌症患者的I期临床研究中研究抗IGSF8作为癌症免疫疗法的安全性和临床活性。
DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.039
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