INTRODUCTION
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研究介绍
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研究背景
Background
单细胞基因组技术的最新进展提供了关于组织内细胞的RNA，蛋白质和染色质状态的前所未有的数据量。这些进展极大地改善了我们理解组织的细胞和分子组成以及它们在病理学过程中如何受到干扰的方式。
尽管取得了这些重要的进展，但我们仍然缺乏将细胞转录状态与细胞内翻译后状态有效联系起来的技术，例如与信号通路激活和代谢活动相关的技术。
目前大多数单细胞转录组学技术都仅限于细胞表面蛋白，而大多数信号转导，代谢和转录途径都是细胞内的。转录因子（TF）组合定义了细胞发育轨迹及其对细胞外信号做出反应的潜力，并且已被证明比表面标记物更精确地代表同质细胞亚群。
研究目的
Objectives
该研究在肿瘤模型中全面定位表达精氨酸酶1的细胞，这是一种具有抑制活性的代谢免疫特征，发现了新的Arg1 + Trem2 +调节性髓系( Mreg )细胞，并确定了与这些细胞相关的标志物、代谢活性和途径。本研究建立了INs - seq作为一种广泛适用的技术，用于阐明整合的转录和细胞内图谱，并确定肿瘤中髓系抑制细胞的分子特征。
METHODS
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研究方法
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研究亮点
1 | 该研究建立的INs-seq是一种用于大规模并行记录记录scRNA-seq和细胞内蛋白活性的新集成技术 |
2 | INs-seq通过TF组合和代谢活性定义新的免疫亚群，并且通过分析免疫信号传导、转录因子组合和代谢活性的不同细胞内特征，证明了INs-seq在发现新免疫亚群方面的广泛效用。 |
3 | 在肿瘤内绘制 Arg1 细胞图谱揭示了新型 Trem2 抑制性髓系细胞，并确定了与这些细胞相关的标志物、代谢活性和通路。 |
FINDINGS
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研究发现
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1
INs-Seq：一种整合scRNA - Seq和细胞内蛋白质测量的技术
在该方案中，细胞使用基于甲醇和硫酸铵溶液的固定液固定和渗透，这些固定液沉淀蛋白质，抑制酶活性，并使RNA保存和免疫细胞内染色。然后，透化的细胞可以用荧光基团偶联的抗体在细胞内标记，并根据其细胞内荧光信号强度由荧光激活细胞分类术( FACS )进行分选，然后使用基于微流控的方法进行scRNA - seq。结果证明了INs - seq在标记细胞内蛋白质的同时保留单细胞内mRNA含量的有效性。(图1)
图1
2
INs - Seq将树突状细胞鉴定为BMDC培养中的pp38组分
该研究用TLR4激动剂脂多糖( lipopolysaccharide，LPS )刺激骨髓培养，用TLR4信号级联的下游成分的荧光pp38进行固定和细胞内染色。然后根据BMDC培养物的pp38信号强度，通过FACS进行分选，并使用chromium平台进行处理。通过对每个聚类中pp38富集分数的量化，表明与单核细胞相比，DC中LPS刺激下游的信号传导减弱，包括pp38 MAPK和下游的炎性细胞因子。
图2
3
通过TF靶向全面表征细胞类型
TF组合可以忠实地定义细胞的发育轨迹及其对细胞外信号的反应前景，并可潜在地应用于不同免疫亚群的精确细胞表征。
为了评估INs - seq在体内定位Treg细胞的效率，该研究使用了表达荧光Foxp3报告子的Foxp3 - RFP转基因小鼠，其中Foxp3启动子驱动RFP和Cre重组酶的表达。通过分选TCRb + RFP +细胞和应用INs - seq方案，分选抗体染色的TCRb + Foxp3 +细胞，富集Foxp3 - RFP颈部淋巴结中的Treg细胞，从未固定的Foxp3 - RFP +和固定的Foxp3 +细胞中构建Sc RNA - seq文库。对5483个细胞的scRNA - seq数据进行分析，创建了Foxp3 +固定和RFP +未固定样本中的细胞类型图谱（图3），并使用基于遗传和基于抗体的Foxp3 +策略确定了类似的Treg细胞富集。
该研究通过靶向小鼠循环(淋巴结)和TME中Treg细胞特异性TF Foxp3，证明了应用INs - seq技术将TF标记与sc RNA - seq相结合的可行性。
图3
DISCUSSION
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研究讨论
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研究局限性
1 | 由于目前可用于FACS的荧光基团数量有限，将寡核苷酸标记的抗体结合到现有的技术中以同时定量靶向几十种蛋白质是一个重点。 |
2 | 尽管多年来分化簇( cluster of differentiation，CD )细胞外标志物已被有效地开发和验证，但仍然缺少细胞内蛋白质和PTM的验证标志物。 |
3 | INs - seq固定后，虽然保留了RNA分子的大致数量，但仍然观察到一些RNA片段化。 |
研究总结
该研究结合了现有技术以及特有的分析程序来获取更多细胞内模式信息，能够研究与细胞谱系不一致的细胞内信号，因此，增加了额外的和重要的信号和代谢途径，并显示了它们在不同微环境中对免疫功能的影响。给免疫表征方面的研究提供了更多思路。
参考文献
[1] Katzenelenbogen, Yonatan., Sheban, Fadi., Yalin, Adam., Yofe, Ido., & Svetlichnyy, Dmitry.. (2020). Coupled scRNA-Seq and Intracellular Protein Activity Reveal an Immunosuppressive Role of TREM2 in Cancer. Cell, 182(4), 872-885.e19.
PROFILE
Yonatan Katzenelenbogen
魏茨曼科学研究所
Yonatan Katzenelenbogen是以色列魏茨曼科学研究所免疫学系Ido Amit博士实验室的一名博士生。他专注于开发用于免疫基因组研究的单细胞RNA-seq技术。 他有兴趣破译肿瘤驻留髓系抑制细胞的分子景观，发现免疫治疗的新靶点。Yonatan在魏茨曼研究所获得硕士学位，在以色列希伯来大学获得学士学位。
END
文案 | 韩宇婷
排版 | 韩宇婷
审核 | 韩宇婷
发布｜姜笑南
世界生命科学大会
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