间充质细胞之间存在显著的异质性，包括骨谱系（NCAM1、SPP1 和 BGLAP）、脂肪谱系（APOE、LPL、PPARG 和 CEBPA）和成纤维细胞（PDPN、CSPG4、DCN 和 DPT）（图 2A、2B）。研究根据相关基因的显著表达差异性将其分别标记为AdipoMSC、THY1+ MSC、Fibro-MSC、APOD+ MSCs（图 2A 和 2B）。用于细胞治疗26 (ISCT) 的 3 个基因，即 NT5E (CD73)、THY1 (CD90) 和 ENG (CD105)（图 2C）。这三个基因的表达在 MSC 亚群中高度可变，NGFR (CD271) 在亚群中的表达更为一致，这为其继续用作无偏差 MSC 标记提供了理由（图 2C）。样本之间的间充质细胞频率存在相当大的差异，这可能反映了激活等动态细胞状态或采样差异等技术因素。 Fibro-MSC和THY1+MSC在Cyto TRACE中得分最高说明它们是 MSC 亚群中最原始的，具有更高的细胞分化和增殖能力。此外数据还捕获了两类骨髓内皮细胞AEC和SEC。

不同类型的 MSC 专门产生特定的支持因子，同时它们也表达显著的相互作用。这些不同亚群MSC细胞分泌的细胞因子对人类HSPC具有重要的支持作用，其中AdipoMSC、THY1+MSC分泌典型的HSPC微环境因子水平最高，它们被造血细胞广泛接受但是对HSPC没有很强的异质性。同时这些细胞因子之间有发生串扰和协调调节的可能性，并且不同的非造血亚群对不同的模块做出了贡献。（图3）

在scRNA-seq数据的指导下采用 CODEX 多重成像联合Mesmer51技术，对803132个细胞进行计算注释，涵盖了12个标本中的32种细胞类型，同时揭示了其蛋白水平表型分布的模式，这些个体之间的总体细胞类型分布相似。本研究还检测到了具有非造血表达谱的骨小梁旁细胞的罕见实例（图4D），我们称之为“骨内膜”。在造血骨界面检测到 Osteo-MSC 和成骨细胞，在骨区域中间主要检测到 Podoplanin+ Fibro-MSC（图 4D、4E）。CODEX 细胞类型的蛋白质表达谱与我们的 scRNA-seq 数据很好地对应，匹配的细胞类型得分非常高，最终的细胞类型注释用于在“细胞表型图”（CPM，图 4F）中可视化细胞拓扑结构。

造血需要多个生态位的参与，内皮生态位在健康和恶性造血中的具有非常重要的意义。本研究试图利用CODEX和scRNA-seq图谱进一步揭示内皮生态位内的相互作用。结果显示：小动脉细胞出现在骨小梁附近的频率高于随机预期(图5B)，这表明内皮生态位实际上可能与小动脉生态位结合；HIF1A水平在EMP和GMP中很低，这表明这些细胞没有经历缺氧(图5C)，与它们在供氧血管附近的定位有关；更成熟的髓细胞具有高水平的HIF1A，非小动脉区域的EMP具有更高水平的HIF1A，这表明缺氧的空间模式不是由于固有的细胞类型差异(图5D)。同样，EMP在scRNA-seq图谱中具有最低的缺氧特征评分(图5E)。鉴于骨髓是一个广泛的缺氧环境，这一发现表明一个相对含氧的生态位与早期骨髓形成有关，动脉周围壁龛和内皮壁龛可能以某种方式合作，对早期骨髓形成很重要。

了解骨髓微环境的空间组织对健康的造血和疾病状态具有重要意义。本研究应用骨髓 CODEX 面板探索肿瘤演变和微环境变化，并使用我们的健康图谱作为参考。以阴性淋巴瘤分期骨髓活检 (NSM)作为对照，对用维奈克拉加低甲基化剂 (Ven/HMA) 治疗的髂嵴活检中的三个诊断 (Dx) 和两个配对治疗后 (PostTx) AML 患者样本进行了分析 。研究发现与 NSM 相比，Dx AML 中髓系细胞（不包括成熟髓系细胞）的比例显著增加，（图 6B），Dx 和 PostTx AML 样本的结构发生了明显变化，例如白血病环境中脂肪细胞几乎完全丢失，以及在残留原始细胞的情况下，Tx 30 天后造血功能恢复不完全（图 6C）。AML 中 Adipo 和 THY1+ MSC 的相对频率高 2 到 3 倍（图 6D）。并且鉴定出白血病群体，包括 GATA1+ NPM1c+ 双阳性群体（图 6E）。在各组邻域分析中，Dx AML 标本中，有四个富含母细胞的邻域 - Dx-CN3/CN5/CN9/CN12（图 6G ），其中两个富含 MSC 群体，THY1+ MSC 仅在这些富含母细胞的邻域中显着富集（图 6G）。 Dx-CN9 是一个富含胚泡的邻域，也富含 AEC、骨内膜细胞以及脂肪细胞和 THY1+ MSC，与健康的 EMP 生态位非常相似。两个 PostTx 胚泡富集邻域 (PostTx-CN4/CN14) 类似于 Dx-CN9 和 NSM-早期髓系/小动脉/骨内膜邻域，即动脉-骨内膜早期髓系生态位。该研究还观察到恢复中的 Post-Tx GMP/EMP 邻域不包含 AEC/骨内膜细胞 (PostTx-CN8)，这可能反映了稳态和紧急髓系细胞之间的差异。总体而言，这些数据暗示了标志着造血恢复的保守空间模式。Dx 和 PostTx NPM1 突变母细胞均具有与 GMP 和早期髓系细胞一致的低 HIF1A 水平。PostTx 细胞在治疗后 BCL2 略有下降，线粒体复合物 IV 表达增加。这可能反映了这些 PostTx 细胞对 BCL2 通路的依赖性降低，以及线粒体质量的补偿性增加。