INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background帕金森氏症(PD)是一种常见的神经退行性疾病，影响着全世界600多万人，它是由中脑多巴胺能神经元的丧失引起的，但其根本原因尚不清楚。PD症状最常用多巴胺前体左旋多巴(L-Dopa)或多巴胺受体激动剂治疗，以恢复基底神经节(BG)运动控制通路的活性。然而，由于多巴胺受体在大脑和外周器官的广泛分布，这些药物缺乏特异性，会导致非BG药物的消耗和其他中枢和外周多巴胺系统的干扰。因此，对PD的精确治疗，能够选择性地调节PD影响的回路是非常需要的。操纵特定类型细胞的最有效和精确的方法之一是在感兴趣的组织或细胞类型中特异性表达基因编码重组酶。另一种方法采用细胞类型特异性启动子和/或增强子，但在啮齿动物和灵长类动物模型中，只有一小部分已确定的神经元启动子维持内源性基因表达模式。受能够感染轴突末端的逆行腺相关病毒(AAV)示踪剂发展的启发，研究人员认为可以构建一个靶向和调节特化投射神经元类型的无重组酶系统，包括以下组件:(1)一种逆行的AAV衣壳，可以有效地感染选定的投射神经元的轴突;(2)一种启动子和/或增强子，可以驱动目标投射神经元中有效的基因表达;(3)一种化学发生效应物，可以控制转导神经元的兴奋。重要的是，这种策略不需要基因改造，因此具有在人类临床应用的潜力。在帕金森啮齿动物中，多巴胺缺失导致直接通路活性的深度抑制，而纹状体D1表达多巴胺受体的中棘神经元(D1- msns)的靶向激活有效地挽救了核心运动症状。由于d1 - msn是唯一一种投射到黑质网状部(SNr)的主要纹状体细胞类型，因此它们是实现PD回路特异性调节方法的理想靶点。研究目的Objectives研究人员寻求开发一种无重组酶，逆行的基于aav的策略来精确分离和调节D1-MSNs作为PD的治疗方法。FINDINGS•✦研究发现✦•实验结果1d1 - msn高效逆行AAV衣壳的研制为了找到针对d1 - msn的有效逆行AAV，研究人员首先测试了当前标准逆行AAV衣壳rAAV2-retro在注入信噪比后转导d1 - msn的能力(图1A)。研究人员在C57BL/6J小鼠中初始注射的结果是raav2 - retrov - hsyn - eyfp对纹状体msn进行稀疏标记。为了提高效率，研究人员对不同血清型的AAV衣壳进行了多轮突变。首先，研究人员将多肽片段“LADQDYTKTA”及其侧翼序列与另外两个用于形成rAAV2-retro Cap蛋白的点突变一起插入到其他4种AAV血清型AAV1/5/6/8的等效位置(图1B)。除AAV5突变体外，所有修饰的AAVs都保持了传染性，但只有AAV8突变体AAV8R获得了d1 - msn逆行感染性的改善。研究人员观察到，与注射raav2 - retrohsyn -EYFP的小鼠相比，注射AAV8R-hSyn-EYFP的小鼠EYFP+ MSNs增加4.86±0.22倍(图1C和1D)。接下来，研究人员重点研究了一系列提高AAV一般感染性或逆行效率的突变。在测试的14个突变体衣壳中，AAV8R12是最有效的，与rAAV2-retro相比，注射黑素后，AAV8R12标记的msn多7.72±0.78倍(图1C和1D)。研究人员还观察到AAV8R和AAV8R12在传递到腹侧白质或外侧下丘脑后，对伏隔核的msn进行了强有力的标记，说明这些修饰的AAV衣壳能够转导msn的轴突。图1 用于D1-MSN的高效逆行AAV衣壳和稳健的MSN启动子的开发2d1 – msn强启动子的鉴定为了找到在msn中诱导高水平基因表达的启动子，研究人员分析了Allen Brain Map基因表达数据库，并鉴定出与其他BG结构相比纹状体表达高度富集的8个基因。对于这8个基因，研究人员检查了与增强子和启动子H3K4me1和H3K27ac相关的两种染色质修饰的大脑图谱。研究人员在转录起始位点周围发现了约2 kb的序列，其中H3K4me1和/或H3K27ac水平较高，并将人类基因组(hg38)等效位置的同源序列克隆到AAV主干中。注射到SNr后，在小鼠中测试了它们驱动报告基因表达的能力(图1E;表S2)。在测试的11个启动子中，与常用的启动子hSyn、EF1α和CAG (1F和1G)相比，来自GPR88基因的2259 bp启动子G88P2在msn中表达最高。然后研究人员缩短了G88P2，并制作了两个衍生物G88P3和G88P7，分别长1395和896 bp(图E)，并观察到两者的活性相当。在正常递送后，由G88P3和G88P7启动子驱动的表达EYFP的病毒每只小鼠分别标记3.7±0.66 × 104和3.95±0.73 × 104 MSNs，而由hSyn启动子驱动的病毒每只小鼠标记1.61±0.16 × 104 MSNs(图1G)。与小鼠纹状体中Gpr88的内源性表达模式一致，研究人员发现静脉注射AAV-PHP后，EYFP与Drd1和Drd2共染色，但未与小白蛋白(PV)、生长抑素(SST)或ChAT共染色。eB-G88P7-EYFP交付。接下来，研究人员确定了G88启动子与AAV8R12衣壳一起递送至SNr时的表达模式。在小鼠黑质注射AAV8R12-G88P7-EYFP后，纹状体中有97.68%±0.43%的标记神经元。标记神经元分别位于信噪比区和其他上游脑区，分别为1.14%±0.16%和1.18%±0.41%(图1H和1I)。小鼠神经注射AAV8R12-G88P7-EYFP后，EYFP与Drd1或Drd2的双重标记表明，所有逆行标记的神经元均为Drd1+， <3%的神经元显示Drd2阳性免疫反应(图1J-1L)。据报道，一小部分snr -突出的msn同时表达Drd1和Drd2受体。同样，在Drd1-Cre和Drd2-Cre小鼠中同时注射AAV8R12- g88p7 - eyfp和纹状体注射AAV9-G88P7-DIO-tdTomato证实，在Drd2-Cre小鼠中，AAV8R12标记的snr靶向msn <3%为tdTomato+。总的来说，研究人员发现12.44%±2.3%的d1 - msn在注射小鼠中呈报告阳性。然后，研究人员在灵长类动物身上测试了D1-MSN逆行标记系统的有效性。将aav8r12 - g88p53 -mCherry单侧注射到猕猴(Macaca fascularis)的信噪比中，结果显示尾状核和壳核(CPu)的投射神经元得到了强大的标记，CPu中有20.55%的d1 - msn表达mCherry，其他部位的标记量很少(图2A-2D)。报告基因和DRD1或DRD2的双重标记表明AAV8R12只标记d1 - msn(图2E-2G)。总之，这些数据证明了逆行AAV衣壳和启动子组合在d1 - msn中选择性表达的能力。图2 食蟹猕猴神经注射AAV8R12后D1-MSNs的鲁棒标记3小鼠BG直接通路的化学发生操作及化学发生效应物的优化为了测试研究人员是否可以特异性调节转导的msn的活性，研究人员将AAV8R12-G88P3-HA-hM3Dq单侧注射到小鼠SNr中，该基因表达被设计药物(DREADD)效应物hM3Dq特异性激活的设计受体，并在氯氮平n -氧化物(CNO)给药时激活神经元。解剖分析显示，标记神经元大部分位于纹状体，标记神经元均为Drd1+(图3A-3C)。通过切片全细胞电压夹记录，研究人员发现在CNO给药后，AAV8R12-G88P3-HA-hM3Dq-2A-EYFP转导的msn的兴奋性增强，而不影响基础放电率或静息膜电位(图3D和S3B-S3D)。令人惊讶的是，研究人员观察到腹腔内注射(i.p)后的对抗性旋转减少。与生理盐水注射相比，CNO递送量(图3E)。这一结果表明直接通路的抑制或间接通路的兴奋，与单侧纹状体D1-MSNs激活的预测结果相反。根据观察到的逆行AAV感染模式，研究人员推断逆行性旋转可能是激活同侧SNr的结果，SNr是BG的主要抑制输出中心，局部注射的AAV轻度转导(图1H, 1I, 3A)。免疫组织化学分析证实，CNO处理后，黑质c-Fos+细胞显著增加，而生理盐水处理后则没有(图3E)。为了进一步探讨这一观察结果，在单侧神经性AAV分娩后，在同侧纹状体背内侧区域附近颅内给予CNO或生理盐水。通过这种方法，CNO而非生理盐水诱导了相反的旋转，研究人员没有观察到黑质c-Fos+细胞数量的显著变化(图3F)。此外，CNO没有引起接受神经性AAV8R12-G88P3-EYFP注射的动物的行为改变。这些结果表明，由研究人员改良的逆行aav标记的D1-MSNs的化学发生激活足以驱动小鼠的行为变化，但它们也强调了研究人员需要进一步优化研究人员的方法，以允许D1-MSNs在全身配体递送后特异性激活。为了改进研究人员的方法，研究人员试图确定一种替代的化学发生效应物，它将允许对d1 - msn进行特异性操作，并且与全身配体输注兼容。常用的gq偶联效应物引起细胞Ca2+浓度的升高，与耦合其他第二信使的DREADDs相比，gq偶联效应物在驱动神经元兴奋方面更有效。因此，研究人员想知道一种不同的化学发生效应物rM3Ds，它使用环AMP (cAMP)作为第二信使，可以有效地激活纹状体msn，是否会在全身CNO给药后激活D1-MSN而不激活神经神经元。为了验证这一点，研究人员将AAV8R12-G88P7-rM3Ds-2A-EYFP单侧注射到成年小鼠的SNr中。免疫组织化学和原位杂交(ISH)分析证实，大多数标记神经元位于纹状体，所有逆行转导的神经元均为Drd1+(图3G-3I和S3 G).切片电生理记录显示，CNO给药后，标记纹状体msn的兴奋性增加，但对基础放电率或静息膜电位没有影响(图3J)。研究人员发现，腹腔和颅内(i.c)输注CNO均可诱导反向旋转，且未增加黑质c-Fos+细胞的数量(图3K和3L)。此外，CNO在接受AAV8R12-G88P7-EYFP注射到SNr的动物中没有诱导旋转行为图3 D1-MSNs的化学发生激活可驱动小鼠强健的运动行为4猕猴BG直接通路的化学发生操作尽管非人灵长类动物(NHP)模型在神经科学研究中的重要性，但神经回路标记和操作技术在这些动物中的应用只取得了有限的成功。神经活动的化学发生操作，虽然不是针对特定的神经回路，已经证明了它在猕猴大脑中的有效性。为了在灵长类动物中验证研究人员的BG直接通路调节方法，研究人员将AAV8R12-G88P3-HA-hM3Dq或AAV8R12-G88P7-rM3Ds-2A-EYFP单侧注射到食食猴的信度比中。大部分标记神经元位于中央处理器，纹状体DREADD+神经元均为DRD1+(图4A-4H)。麻醉动物的电生理记录证实，CNO(而非生理盐水)输注后，中央处理器神经元活动增加(图4I-4L)。为了直接评估rM3Ds在D1-MSNs中的表达对其活性的影响，研究人员在小鼠和猕猴体内同时注射了AAV8R12-G88P7-HA-rM3Ds-2A-Cre和纹状体AAV9-EF1α-DIO-ChR2-EYFP。小鼠免疫组织化学分析和切片记录证实ChR2和rM3Ds在纹状体突起神经元中共表达，并显示标记的神经元在光照(473 nm)和CNO下均被激活。麻醉猕猴的体内光标记记录显示，CNO有效诱导转导d1 - msn的神经元活动增加(图4M-4P)。在行为测试中，分别在接受hM3Dq或rM3Ds效应物的猴子中，向尾状核背内侧输注CNO或全身输注CNO，可引起对立性旋转的急剧增加(图4Q-4T;视频S1和S2)。经CNO处理后，研究人员还观察到动物在观察笼顶部隔间的停留时间明显减少，而对角旋转速度明显增加(图4U-4X、S4E和S4F)。在剧烈旋转的速度、总移动距离或静止时间方面没有发现显著差异，并且CNO没有引起未注射猴子的显著行为改变。总之，这些结果支持使用研究人员的方法来精确分离和激活灵长类动物的直接通路投射神经元。许多潜在的治疗干预措施在最初在啮齿动物模型中证明有效后，在临床试验中失败了。因此，研究人员试图在灵长类动物PD模型中评估研究人员的方法的临床潜力。研究人员首先测试了不同的方法来建立帕金森病NHP模型，并选择在SNc中局部注射1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)来真实准确地诱导猕猴的稳健帕金森病。为避免出现影响SNr D1-MSN轴突治疗性AAV感染的并发症，考虑到MPP+注射到邻近SNc，研究人员修改了检测方案，在输注黑毒素之前逆行注射AAV。然后，研究人员用啮齿动物PD模型证实，相反的测试顺序导致帕金森症状的明显缓解。接下来，研究人员将AAV8R12逆行立体定向注射到成年食蟹猕猴的9个信噪比位点。然后将MPP+单侧注射到SNc中，通过TH免疫组化证实SNc中多巴胺神经元及其中央CPu纤维的丢失。为了激活猕猴大脑中的DREADD，研究人员使用了去氯氯氮平(DCZ)，这是一种有效的rM3Ds脑穿透激动剂，与CNO相比，它的脱靶结合减少。麻醉动物的体内电生理记录显示，DCZ或CNO，而非生理盐水，可诱导MPP+损伤猕猴的神经元活动增加。注射MPP+的猴子表现出典型的pd样症状，包括运动迟缓、震颤、僵硬和姿势异常。通过全身DCZ治疗而不是生理盐水治疗，研究人员观察到所有被试猴子的典型帕金森症状逆转(图6I-6S和S6E-S6H)。首先，研究人员在观察笼中观察到自发运动的增加，活动水平接近MPP+注射前的水平。其次，DCZ治疗后震颤明显减轻或消除。第三，研究人员通过d1 - msn的化学激活观察到运动技能的显著恢复。此外，DCZ的有效剂量(0.3 mg/kg)并没有改变幼稚猴子的运动相关行为。重要的是，在连续8个月的DCZ治疗期间，帕金森症状的缓解是一致的。此外，动物无运动障碍，治疗期间常见肝肾相关因子的血液水平保持稳定。总之，这些数据有力地支持了研究人员逆转帕金森灵长类动物核心疾病表型的方法的安全性和有效性。接下来，研究人员比较了此方法与左旋多巴的疗效，左旋多巴是帕金森病最常见的治疗方法。虽然研究人员观察到两种方法对帕金森症状的逆转相似，但在给药初期，dcz介导的靶向回路激活显示症状的逆转比左旋多巴更快。在药物达到稳态疗效后，DCZ延长了每次给药后的疗效窗口期，至少在给药后24小时内缓解症状，远远长于临床观察到的左旋多巴的治疗窗口期。研究人员在药物输注24小时后采集脑脊液样本，未发现可检测到的DCZ水平，提示神经网络动力学发生变化或残留的DREADD配体有显著影响。此外，研究人员的方法没有引起运动障碍样行为，这在长期服用左旋多巴后很明显。至关重要的是，长期(4个月)服用左旋多巴并不影响DCZ的疗效或运动障碍的消失。总之，这些结果显示了研究人员的方法在NHP PD模型中的有效性，并支持其治疗人类PD的可行性。图4 D1-MSNs的化学发生激活驱动了猕猴强健的运动行为DISCUSSION•✦研究结论✦•总的来说，我们开发的精确基因治疗方法有可能改变PD治疗的前景，并为其他脑部疾病的靶向、基于神经回路的治疗策略的发展提供启示。参考文献[1] Chen, Y., et al., Circuit-specific gene therapy reverses core symptoms in a primate Parkinson's disease model. Cell, 2023. 186(24): p. 5394-5410.e18.END文案 | 李贺轩排版 | 李贺轩审核 | 李贺轩发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background地塞米松（Dexamethasone，DXMS）是糖皮质激素（GC）的一种，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用。于1957年首次合成，并列名于世界卫生组织基本药物标准清单之中，为基础公卫体系必备药物之一。2020年6月，COVID-19 治疗随机评估 （RECOVERY） 平台试验的初步数据表明，地塞米松可挽救 COVID-19 重症患者生命，可将需要机械通气的重症 COVID-19 患者的 28 天死亡相对风险降低约 30%，对于仅吸氧的患者，可将其死亡率降低约20%。1尽管地塞米松的临床有效性已得到证实，但仍有大量患者的病情发展为危重并最终死于 COVID-19，这些患者对地塞米松的治疗反应显然无效或几乎无效。总体而言，地塞米松在重症 COVID-19 中的作用机制尚不清楚，并且缺少治疗反应或治疗失败的生物标志物，治疗失败的案例无疑强调了寻找地塞米松挽救生命相关的分子标志的重要性。研究意义Significance来自德国神经退行性疾病研究中心和柏林夏里特医学院的研究人员，在期刊《Cell》发表新的研究成果，“The life-saving benefit of dexamethasone in severe COVID-19 is linked to a reversal of monocyte dysregulation”。研究结果将地塞米松的作用与特异性免疫调节和单核细胞失调的逆转联系起来，并强调了单细胞组学在监测体内免疫调节药物靶向作用和为精准医学方法中的患者分层提供依据方面的潜力。2（图1）图1METHODS•✦研究方法✦•研究亮点1单细胞转录组测序（scRNA-seq）：用于识别地塞米松治疗引起的单核细胞状态的特定变化，并分析其与临床结果的关联。2质谱流式检测（CyTOF）：区分和量化血液中的各类免疫细胞，包括它们的数量和比例，以及它们在地塞米松治疗前后的变化。3基因富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）：用于分析全血转录组数据，以确定与地塞米松治疗反应相关的基因集，并评估治疗效果。FINDINGS•✦研究发现✦•一、地塞米松治疗引出的免疫调节为了确定地塞米松治疗在 COVID-19 患者中诱导的细胞和分子变化，研究人员选取2020年3月至2021年2月期间感染SARS - CoV - 2 D614G毒株的COVID - 19患者，分为地塞米松治疗组（Dexa）和未治疗的对照组(ctrl.)，利用CyTOF、scRNA-seq和多色流式细胞术，对全血和外周血单核细胞（PBMCs）进行高维单细胞分析。地塞米松治疗组中，白细胞的数量显著增加，特别是中度疾病患者。这种增加主要是由于B细胞和中性粒细胞的变化，而在重度疾病患者中则没有观察到差异。此外，单核细胞的比例在中度疾病患者中相对减少。通过使用CyTOF和scRNA-seq技术，研究人员能够观察到免疫细胞组成的整体变化，地塞米松治疗引起了转录改变，在单核细胞和B细胞中最为明显，且许多与地塞米松治疗相关的基因上调，同时一些与炎症相关的基因表达下调。（图2）图2二、地塞米松诱导的独特细胞状态研究人员比较了地塞米松治疗组与对照组的重度和中度COVID-19患者单核细胞中的差异表达基因（DEGs）。观察到地塞米松治疗抑制了几种促炎基因的表达，并诱导了与疾病严重程度无关的包括已知 GC 反应在内的基因程序，例如 IL1R2、TSC22D3、CD163等。此外，研究人员还发现了一个特定的单核细胞亚群，表现出最高的糖皮质激素反应基因的富集，这表明地塞米松治疗在单核细胞中引起了特定的分子变化。（图3）图3三、与临床生存率相关的诱导调节鉴于仍有部分患者接受地塞米松治疗后无效，研究人员试图探究哪些机制有助于临床治疗获益。发现地塞米松在大多数中度COVID-19患者中，普遍诱发Dexa反应单核细胞状态，在重度COVID-19患者中不太明显，相比于重症幸存者，重症死亡患者的Dexa反应状态单核细胞的频率显然更低。地塞米松治疗的临床效果或与单核细胞对治疗的反应有关。此外，地塞米松治疗逆转了重症COVID - 19患者单核细胞中先前报道的转录失调，使HLA - DRB1、HLA - DRA等基因的表达恢复，S100A等报警素表达下调。在肺部支气管肺泡灌洗液（BAL）的分析中也发现，地塞米松治疗后幸存者的BAL单核细胞和巨噬细胞中也存在类似的转录反应。（图4）图4这些数据将药物干预的临床效果与血液和肺部免疫细胞的分子表型联系起来，可以揭示治疗干预的作用机制，并在临床终点之前识别对特定治疗无反应的患者。结果强调了单核细胞反应在严重 COVID-19 病理生理学中的因果相关性。四、与地塞米松疗效相关的CD14+单核细胞为了研究在转录水平上观察到的地塞米松治疗反应的差异是否反映在单核细胞的表观遗传谱上，研究人员选取治疗开始时需要补充氧气但无需有创机械通气的患者（WHO评分为4 - 5分），生成治疗反应者和非反应者的血液样本全基因组DNA甲基化谱。研究人员发现在治疗开始后的早期阶段（中位2天），CD14+单核细胞在促炎程序方面的表观遗传学差异已经显现，且这些差异早于转录变化。以及从单核细胞转录组中获得的与结果相关的特征基因的富集，进一步支持了该基因程序对治疗成功的重要性。（图5）图5五、全血转录组分析以及分层结果鉴于明显的与结果相关的转录变化，研究人员对来自两个独立COVID - 19队列（单中心和多中心）的患者进行全血批量转录组分析，以验证地塞米松治疗相关的单核细胞转录特征是否能在全血转录组中体现，并用于分层患者结果。在平均治疗后4天（单中心队列）和2天（多中心队列）采集的全血转录组中，基于单核细胞转录组的特征基因标志能够富集，并且可以根据疾病严重程度和结果对患者进行分层。治疗后4天采集的样本中可以检测到单核细胞转录组的临床结果相关基因特征富集；在独立队列中，治疗后2天采集的样本中只能检测到基于下调基因的特征基因的富集，说明地塞米松治疗效果在治疗开始后2至4天之间开始在全血转录组中显现。（图6）图6这表明，单细胞测序技术能够揭示药物治疗的体内效应，并且这些分析中获得的基因特征可以应用于更大的临床队列，以在治疗开始后的早期时间点对患者进行分层。DISCUSSION•✦研究讨论✦•研究局限性1研究基于两个观察性队列：并非专门设计用于研究地塞米松治疗效果，且受限于早期疫情阶段，免疫和病毒学特征可能随时间变化。2由于伦理原因：在重症COVID - 19患者中扣留地塞米松是不道德的，难以生成新的数据来进一步验证研究结果。小结Summary这项研究为地塞米松治疗对 COVID-19 患者的免疫调节作用提供了单细胞水平的解析分子表型信息，这些信息可用于未来关于地塞米松治疗重新评估的临床决策。结合基于转录组的反向药物靶点预测方法和随机对照试验，该方法可以为未来新发传染病的更快药物再利用解决方案奠定基础，甚至可能成为开发其他感染性和非感染性疾病精准医学的蓝图。参考文献[1] Horby, Peter., Lim, Wei Shen., Emberson, Jonathan R., Mafham, Marion.,  & Bell, Jennifer L.. (2020). Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19. The New England journal of medicine, 384(8), 693-704.[2] Knoll, Rainer., Helbig, Elisa T., Dahm, Kilian., Bolaji, Olufemi.,  & Hamm, Frederik.. (2024). The life-saving benefit of dexamethasone in severe COVID-19 is linked to a reversal of monocyte dysregulation. Cell.PROFILEAnna C. Aschenbrenner波恩大学、德国神经退行性疾病中心（DZNE）预防、衰老和系统免疫学组组长研究小组使用最新的免疫学、功能基因组学方法和计算机辅助分析高维数据集的方法，借助统计和生物信息学方法进行研究。研究重点是免疫系统的老化过程；感染是免疫系统过早老化的诱因；以及改善免疫系统，防止衰老过程。END文案 | 姜笑南排版 | 姜笑南审核 | 姜笑南发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background猪链球菌是一种猪病原体，也能引起人类的人畜共患病。感染猪链球菌的人类患者可能出现败血症、脑膜炎或关节炎。相比于脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等常见病原体，人类感染猪链球菌的报告非常少见。1968年在丹麦首次报告了人类感染猪链球菌的病例。迄今为止，全球已报告了1600多例猪链球菌感染病例，尽管医疗错误率高且诊断或治疗不准确或不完整。猪链球菌Streptococcus suis主要通过皮肤的伤口直接接触而感染。临床表现为发热、寒战、头痛、食欲下降等一般细菌感染症状，重症患者可合并中毒性休克综合征。DETAILS•✦病例资料✦•一名57岁的男性于2023年11月15日被送往周口市第一人民医院。他数天来一直感到背痛，但未接受任何治疗。吃早餐时，他突然出现意识障碍（神志不清，胡言乱语，颈部僵硬。格拉斯哥昏迷评分（GCS）为12（正常上限为15））CT显示大脑正常，第二天被转送至郑州大学第一附属医院。实验室检查：白细胞计数：20.9 × 10^9/L（参考值：4 × 10^9/L至10 × 10^9/L）降钙素原：10.7 ng/mL（参考值：<0.5 ng/mL）C反应蛋白：40.68 mg/L（<6 mg/L）肝功能：天冬氨酸氨基转移酶（AST）：75 U/L（0-40 U/L）脑钠肽（BNP）：4695 pg/mL（0-100 pg/mL）颅内压：200 mmH2O（参考范围：80-180 mmH2O）白细胞计数：1760 × 10^6/L（参考范围：0 × 10^6至5 × 10^6/L）葡萄糖水平：0.51 mmol/L（参考范围：2.5-4.5 mmol/L）Cl-：118 mmol/L（参考范围：120-130 mmol/L）Pandy试验阳性（潘氏试验）蛋白质值高达5458 mg/L（参考范围：150-450 mg/L）脑脊液培养阴性，但通过mNGS检测到猪链球菌。脑部MRI：T1加权、T2加权序列和液体衰减反转恢复（FLAIR）正常。对比增强MRI显示脑膜增强和蛛网膜颗粒增大。腰椎MRI显示椎间盘突出和腰椎间隙水肿。RESULT•✦临床结局✦•初步诊断为猪链球菌脑膜炎和败血症。患者接受了美罗培南（每12小时1克剂量）的抗生素治疗，意识恢复，GCS评分为15。然而，两天后，患者出现双侧突发性耳聋。随后进行了第二次腰椎穿刺，颅内压为135 mmH2O，白细胞计数减少到46 × 10^6/L，葡萄糖浓度为1.94 mmol/L，氯化物为120 mmol/L，蛋白质为1781 mg/L。第二次脑脊液检查再次通过mNGS检测到猪链球菌。随后患者接受了甲基强的松龙脉冲治疗（每日80毫克），通过静脉滴注。经过两周的抗感染治疗，患者认知功能有所改善，但依然存在听力下降和头晕，并被送往耳鼻喉科接受人工耳蜗植入手术。DISCUSSION•✦研究讨论✦•1猪链球菌作为人畜共患病的潜在威胁 猪链球菌不仅是猪的病原体，也能感染人类，导致严重的疾病，如败血症、脑膜炎和关节炎。这表明在人类与动物密切接触的情况下，特别是职业暴露者，如屠夫、农民等，需要高度警惕这种病原体的潜在感染风险。2人类感染猪链球菌的稀有性与严重性虽然人类感染猪链球菌的报告相对较少，但一旦感染，症状可能非常严重，甚至致命。强调了对这种病原体的诊断和研究的重要性，以便提高对疾病的认知和处理能力。3临床表现与实验室检查病例描述中的患者出现了典型的化脓性脑膜炎症状，如背痛、意识障碍、发热和颈部僵硬，实验室检查显示了显著的炎症标志物和脑脊液异常。及时而准确的实验室检查（如mNGS）对于确诊猪链球菌感染至关重要，特别是在脑脊液培养阴性的情况下。参考文献[1] Liu T, Liu H, Jia Y. Streptococcus suis meningitis in China: a case report. Front Public Health. 2024 May 14;12:1369703. doi: 10.3389/fpubh.2024.1369703. PMID: 38808002; PMCID: PMC11130402.END文案 | 杨青林排版 | 杨青林审核 | 杨青林发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background随着肿瘤免疫治疗的兴起，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的异质性及其在肿瘤微环境中的关键作用日益受到关注。TAMs 可分为促炎型（M1）和抗炎型（M2）两种表型，它们在肿瘤发生发展、免疫抑制和免疫逃逸中扮演着截然不同的角色。M1 型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，启动和维持炎症反应，清除病原体和肿瘤细胞，促进免疫细胞的募集和活化，抑制肿瘤生长和转移。M2 型巨噬细胞具有促肿瘤活性，抑制炎症反应，促进血管生成和组织修复，抑制免疫细胞的募集和活化，促进肿瘤生长和转移。M1 型巨噬细胞受到促炎因子如 LPS 和 IFN-γ 的刺激后，会诱导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，进而催化 L-精氨酸转化为 NO。因此，M1 型巨噬细胞会产生大量的 NO。M2 型巨噬细胞受到抗炎因子如 IL-4 的刺激后，iNOS 的表达会被抑制，因此其不会产生或仅产生少量的 NO。因此，可以通过检测巨噬细胞中NO的含量来鉴别不同极化状态的巨噬细胞。现有的 NO 探针大多存在光稳定性差、光损伤等问题，且多为单一成像模式，易受环境干扰和自荧光影响。为了克服传统方法的局限性，中山大学研究团队开发了一种新型的线粒体靶向型双光子铱配合物磷光探针 Ir-ImNO 用于实时、准确地监测 TAMs 的极化状态。研究亮点Objectives理性探针设计：Ir-ImNO 探针分子以铱配合物为发光母体，引入N5-苄基-1,10-菲罗啉-5,6-二胺 (BPDA) 作为识别NO的响应基团。当 NO 存在时，BPDA 会与 NO 发生反应，形成新的三唑化合物，导致 Ir-ImNO 探针分子结构的改变，继而影响 Ir-ImNO 探针分子的能量跃迁过程，导致磷光强度和磷光寿命的变化。（图1）图1 探针的结构和应用高灵敏度、高选择性： Ir-ImNO 对 NO 具有极高的灵敏度和选择性，能够检测低浓度的 NO，检测限低至 14 nM，并排除其他生物活性物质或离子的干扰。多模态成像能力： Ir-ImNO 可用于单光子显微镜、双光子显微镜和磷光寿命成像等多种成像模式，从而实现对 TAMs 极化状态的全面监测。线粒体靶向能力： Ir-ImNO 能够特异性地靶向细胞线粒体，从而更精确地检测细胞线粒体内 NO 的变化。良好生物安全性： Ir-ImNO 对细胞和红细胞均无毒性，具有良好的生物安全性。FINDINGS•✦研究发现✦•1.多模态成像分析TAMs 极化状态研究人员利用 Ir-ImNO 探针，成功地对细胞和活体小鼠中的 TAMs 极化状态进行了多模态成像分析。利用磷光强度成像技术，研究人员发现，LPS/IFN-γ 诱导的 M1 型巨噬细胞会产生强烈的橙黄色磷光信号，而 IL-4 诱导的 M2 型巨噬细胞则产生十分微弱的磷光信号。（图2）图2 利用磷光强度成像技术鉴别M1和M2巨噬细胞利用磷光寿命成像技术，研究人员观察到 M1 型巨噬细胞发出绿色的伪色信号（610 ns），而 M2 型巨噬细胞则发出黄色的伪色信号（867 ns）。这种颜色信号差异是由于磷光寿命的差异造成的，从而可以更直观地区分两种表型的巨噬细胞。（图3）图3 利用磷光寿命成像技术鉴别M1和M2巨噬细胞上述结果表明，Ir-ImNO 能够有效地识别和区分 M1 和 M2 表型的 TAMs，并通过磷光强度和磷光寿命的变化反映其极化状态以及免疫反应状态。2.监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响Ir-ImNO 还可用于监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响，从而评估其免疫治疗效果。研究人员利用 Ir-ImNO 探针监测了 FLT3 受体酪氨酸激酶抑制剂 Pexidartinib (PLX3397) 对 TAMs 极化状态的影响，发现 PLX3397 能够促进 TAMs 从促瘤型 M2 表型转化为抑瘤型 M1 表型，从而抑制肿瘤生长。（图4）图4 探针监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响DISCUSSION•✦研究讨论✦•本研究开发了一种新型的线粒体靶向型双光子铱配合物磷光探针 Ir-ImNO，并利用其实现了对巨噬细胞极化状态的精准“追踪”。该探针具有高灵敏度、高选择性、多模态成像和生物安全性等优势。Ir-ImNO 探针的开发为 TAMs 极化状态的监测提供了一种新的工具，有助于深入理解肿瘤免疫机制和评估免疫治疗效果。未来，Ir-ImNO 探针有望在肿瘤免疫治疗领域发挥重要作用，并为开发新型免疫治疗药物提供理论依据。参考文献[1] Yuxin Wen,Xianbo Wu,Weijun Wu, Tao Feng, Yihang Pan, Yulong He, Liangnian Ji,and Hui Chao. A Mitochondria-Targeted Nitric Oxide Probe for Multimodality Imaging of Macrophage Immune Responses.  Anal. Chem. 2024, 96, 6666−6673.END文案 |陆细刚排版 | 陆细刚审核 | 陆细刚发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background小细胞肺癌（SCLC）约占肺癌病例的15%并且预后不良，大约2/3的患者处于广泛期（ES）疾病状态，5年总存活率只有1-5%。免疫检查点抑制剂结合以铂为主的化疗方案已经报道和延长的中位生存期有关。贝莫苏拜单抗是一种人源的抗PD-L1抗体，已经展现出和其他免疫检查点抑制剂相似的临床前抗肿瘤活性。安罗替尼与免疫检查点抑制剂有潜在的协同作用。有一项1b期剂量递增试验探究了安罗替尼和贝莫苏拜单抗结合展现了良好的安全性，并且6个ES-SCLC患者中有4个得到部分反应。研究目的Aim探究化疗方案中加入贝莫苏拜单抗和安罗替尼是否能够在ES-SCLC的一线治疗展现协同效应以及化疗方案中只加入安罗替尼是否临床有益。METHODS•✦研究方法✦•1ETER701 (NCT04234607) 是在中国72个地点进行的多中心双盲双模拟随机化安慰剂对照三期临床试验。所有有资格的病人被中央随机分配以1:1:1的比例接受以下三个治疗方案之一：1. 贝莫苏拜单抗+安罗替尼+依托泊苷/卡铂（EC），随后贝莫苏拜单抗和安罗替尼维持治疗；2. 贝莫苏拜单抗安慰剂+安罗替尼+EC，随后安罗替尼维持治疗；3. 贝莫苏拜单抗安慰剂+安罗替尼安慰剂+EC，随后安慰剂维持治疗。随机化方法是中央分层随机化。治疗分配屏蔽患者、他们的家人或者监护人、研究者、本地和中央放射学审查员，研究统计学家、参与数据清理和数据分析的数据管理人员、研究赞助人直到最终的数据库被锁定。中期分析是由独立的数据监察委员会以非盲方式进行的。2ETER701试验评估两个主要有效性终点：无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。独立评审委员会（IRC）根据RECIST 1.1评估PFS，定义为从随机化到第一次记录疾病或死亡的时间。OS定义为从随机化到死亡的时间。次要终点包括IRC根据RECIST1.1评估的客观应答率，定义为实现完全应答和部分应答的参与者比例。生存分析用Kaplan–Meier方法，用分层log-rank检验。风险比（HR）和相关95%置信区间（95%CIs）用分层Cox比例风险模型评估。治疗组之间应答率的差异用Cochran–Mantel–Haenszel检验评估。3EQ-VAS问卷评估健康相关生活质量（HRQoL）。混合模型重复测量方法用来比较EQ-VAS从基线的变化。FINDINGS•✦研究发现✦•1.  病人和治疗图1 患者处置1005个病人进行了资格评估。738个病人随机接受治疗（意向治疗人群）。246个病人被分配接受贝莫苏拜单抗+安罗替尼+依托泊苷/卡铂（EC），245个接受安罗替尼+EC，247个接受EC（图1）。在738个患者中736人接受至少一剂方案治疗（安全人群）。在完成诱导治疗后，三组中214、208、208个患者分别接受计划的维持治疗。计划的总生存期中期分析中有89个病人仍处于指定的治疗中（图1）。2. 主要终点OS图2 意向治疗人群的OS在预先指定的OS中期分析中，贝莫苏拜单抗+安罗替尼+EC组病人的中位OS大于EC组（19.3个月（95%CI 14.2-不可估计）vs 11.9个月（95%CI 10.7-13.4）；P=0.0002；风险比0.61（95%CI 0.47-0.79）），满足统计学显著性预先指定的标准（图2）。安罗替尼+EC组的OS和EC组的没有显著差异（13.3个月（95%CI 11.1-15.1）vs 11.9个月（95%CI 10.9-13.4）；风险比0.86（95%CI 0.67-1.10; P=0.1723））（图2）。PFS图3 意向治疗人群的PFSPFS是由独立评审委员会（IRC）根据 RECIST 1.1评估的。在PFS的预先指定的最终分析中，贝莫苏拜单抗+安罗替尼+EC组的PFS显著比EC组的长（6.9 个月（95% CI 6.2–8.3）vs 4.2 个月（95% CI 4.17–4.24）； 风险比0.32（95% CI 0.26–0.41）；P < 0.0001）（图3）。安罗替尼+EC组的PFS显著比EC组的长（5.6 个月（95% CI 5.6–6.8）vs 4.2个月（95% CI 4.17–4.24）；风险比0.44（95% CI 0.36–0.55）；P < 0.0001）（图3）。3.次要终点表1 盲态独立中心评估根据RECIST1.1评价肿瘤反应IRC评估的有客观应答的病人在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼+EC组占比是81.3%（95% CI 75.9–86.0；P=0.0001），安罗替尼+EC组中占比81.2%（95% CI 75.8–85.9；P=0.0003），两者都显著比EC组中占比高（66.8%; 95% CI 60.6–72.6）。有3个病人在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼 +EC组（1.2%），1个在安罗替尼+EC组（0.4%）得到完全应答（表1）。4. 安全性表2a 安全性总结表2b 治疗期间出现的不良反应表2c 治疗相关不良反应任何级别的治疗期间出现的不良事件100%发生在每个组中，在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼 +EC，安罗替尼 +EC，EC组中级别大于等于3的治疗期间出现的不良事件分别占94.3%，95.9%和89.0%（表2a），最常见的毒性包括血小板减少症，中性粒细胞减少症和白细胞减少症（表2b）。治疗相关不良反应在三组中的占比分别为100%，99.6%和99.6%，级别大于等于3的分别是93.1%, 94.3%和87.0%（表2c）。治疗相关不良反应导致死亡在三组中的比例分别为4.5%, 2.5%和1.6%（表2a）。严重不良事件在三组中的占比分别为54.9%, 48.8%和41.1%，级别大于等于3的分别是46.7%, 43.4%和34.1%（表2a）。免疫相关不良事件在三组中的占比分别为42.7%，27.5%，19.1，级别大于等于3的分别是16.7%, 8.2%和6.9%（表2a）。5. 健康相关生活质量（HRQoL） 图4 患者报告的与健康相关的生活质量的结果在所有意向治疗人群治疗组中，EuroQol visual analog scale （EQ-VAS）分数从基线到第34周的平均变化总体上升（表示改善）。每次访问研究组之间的EQ-VAS分数没有显著改变（图4）。•✦研究讨论✦•这个三期试验表明安罗替尼、贝莫苏拜单抗和化疗的结合可能在ES-SCLC一线治疗中对病人OS和PFS有利。严重不良事件在两个治疗组发生相对频繁，支持性护理或者剂量调整用来解决这些事件。剂量调整是一个最大化治疗效果减少毒性的常用策略。这个研究的局限性是没有免疫化疗对照。总结研究意义ETER701试验满足了预先计划的中期分析的主要终点，确认了用安罗替尼、贝莫苏拜单抗和化疗结合作为一线治疗和化疗相比能够显著提高ES-SCLC病人的OS，PFS和应答率。和化疗相比，安罗替尼和化疗结合能够提高PFS和应答率，但是OS没有显著差异。参考文献[1] Cheng, Y., Chen, J., Zhang, W., Xie, C., Hu, Q., Zhou, N., Huang, C., Wei, S., Sun, H., Li, X., et al. (2024). Benmelstobart, anlotinib and chemotherapy in extensive-stage small-cell lung cancer: a randomized phase 3 trial. Nat Med. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41591-024-03132-1 END文案 | 林夕排版 | 林夕审核 | 林夕发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展