INTRODUCTION
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研究介绍
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研究背景
Background
NADPH氧化酶(NOX)家族的主要产物是活性氧(ROS),因此在活性氧平衡中有着主要功能。NOXs属于三价铁还原酶跨膜(TM)成分样结构域(FRD)超家族。它有1个由2个保守结构域组成的催化核心:1个6个TM螺旋的结构域通过4个保守组氨酸残基配位结合2个血红素;1个胞浆中的C端脱氢酶结构域包含FAD和NADPH结合位点(图1a)。
Streptococcus pneumoniae NOX (SpNOX)是被研究最多的成员,可以得到高的产量、稳定性和酶活。Cylindrospermum stagnale NOX5(csNOX5)的TM和脱氢酶结构域晶体结构分别被鉴定,但是还没有得到全长NOX的结晶。小鼠和人类DUOX1和失活的人类核心NOX2复合物的cryo-EM结构已经被解析,它们提供了关于亚基相互作用和真核NOXs催化调节的必要信息,但是有关激活和催化转换的机制还不清楚。由于SpNOX的纯化和表达相对简单和它与真核NOXs的同源性,SpNOX的结构鉴定可能对它应用于作为NOXs模式系统是有价值的。
研究目的
Aim
鉴定SpNOX的结构并揭示SpNOX催化的结构基础。
METHODS
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研究方法
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1 | 蛋白的表达与纯化:S. pneumoniae R6株的NOX被表达在E.coli细胞中,IPTG加入培养物中,加入δ-氨基乙酰丙酸来最大化血红素生成。匀浆使细胞裂解,沉淀细胞碎片,通过高速离心将膜从上清液中分离。然后膜的沉淀在裂解液中被重悬,然后样本加入0.4%月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)搅拌使溶解。去除不溶性物质后上清液和用裂解液平衡的Ni-NTA树脂相互混合,上柱后用加入5mM咪唑和0.002%LMNG的裂解液洗柱,蛋白用300mM咪唑洗脱,然后立即用加入0.002%LMNG的无咪唑裂解液以1:1比例稀释来防止蛋白聚集。His-PreScission蛋白酶加入样本去除6His tag。样本离心后加入20mM咪唑后加到用含20mM咪唑和0.002%LMNG溶液平衡的Ni-NTA柱上。包含没有tag蛋白的流穿液浓缩后进一步用凝胶过滤层析纯化。 |
2 | 酶活测定:SpNOX的NOX活性是用细胞色素c还原试验测定的。室温下0.5ml最终溶液中有50 mM Tris pH 7.0,250 mM NaCl和100 µM 牛心脏细胞色素c,加入0.1 µM SpNOX和1 µM FAD,反应由加入NADPH或NADH开始。当需要时,牛超氧化物歧化酶被加入试验中。NADPH的氧化与细胞色素c的还原分别由在340nm和550nm处的吸光度测定。SpNOX的铁还原酶活性检测是在无氧室温下进行的,1 ml 最终溶液中包含50 mM Tris pH 7.0,250 mM NaCl,加入0.5µM SpNOX,800 µM菲洛嗪, 100 µM FeIII-EDTA和5µM FAD,反应由加入100 µM NADPH开始,FeIII还原成FeII由562nm处的吸光度反映,菲洛嗪吸光度系数的标准曲线用FeIICl2生成。 |
3 | Cryo-EM测定无底物的SpNOX,NADPH结合的SpNOX,NADH结合的SpNOX,NADPH结合的SpNOX F397A的结构。 |
FINDINGS
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研究发现
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1. SpNOX的纯化,分析和结构测定
NADPH的氧化可以通过细胞色素c还原试验测定,得到Km值7.59 µM和Kcat值8.27 s−1(图1b)。这个蛋白也显示NADH驱动的酶活,得到Km值3.41 µM和Kcat值3.33s−1(图1b)。
除了没有电子供体的SpNOX,他们还测定了在无氧条件下结合NADH的还原性蛋白结构和在有氧NADPH条件下的WT和F397A突变体结构(表1)。
图1 SpNOX表现经典NOX结构和NOX活性
表1 Cryo-EM数据收集,提炼和证实
2. SpNOX的结构
SpNOX的结构与NOX典型结构一致,由1个配位结合2个血红素的N端TM结构域和1个结合FAD的C端脱氢酶结构域构成(图1c-e)。两个血红素六配位结合属于TM3和TM5的组氨酸对(H69和H129,内血红素;H83和H142,外血红素)(图2a,b)。C端脱氢酶结构域展现经典的铁氧还蛋白-NADP+还原酶(FNR)折叠:一个FAD结合区域和一个NADPH结合区域(图2a)。脱氢酶结构域残基H233,S236, S252, T256 和T297与FAD通过氢键相互作用,F397和异别恶嗪环π-π堆积(图2c)。FAD和TM结构域之间唯一直接相互作用是腺嘌呤和Y122之间的π-π堆积(图2c)。脱氢酶结构域是通过FAD区域与TM结构域结合的,主要是与位于B-loop和TM6残基发生直接极性作用(图2d)。而且,在TM3的K70通过氢键与F399相互作用,F399与K398和K400构成SpNOX的C端的一部分(图2e)。
图2 血红素与FAD结合位点和TM和脱氢酶结构域间相互作用
3. SpNOX的NADPH结合位点和电子传递路径
NADPH的烟酰胺部分通过氢键以及C端F397产生的疏水作用力被容纳(图3a)。在SpNOX中,NADPH的2'磷酸基团通过氢键与S348和Y353配位结合(图3a),和真核生物NOXs和NADPH特异的FNR超家族的其他成员的NADPH结合模式不同。在人类DUOX1中,2'-磷酸基团通过盐桥与两个精氨酸残基R1424和R1495配位结合(图3b)。因此NADPH的特异性可能至少部分是由离子间相互作用力产生的,它在SpNOX中的缺失可能可以解释这个酶缺少底物特异性。除此之外,5'-磷酸通过盐桥和R320相互作用,腺嘌呤部分夹在M375侧链和Y353芳香环之间,核糖的3'-OH与S348形成氢键。
血红素之间边缘到边缘的距离是9.8 Å,而异别恶嗪环和内血红素下边缘的距离是9.9Å(图3c)。从烟酰胺C4到异别恶嗪N5的距离为7.2Å作者推断这个结构代表了这个酶的失活状态,因为距离太长而不能有效转移氢负离子(图3c,d)。无法解决一个有效的结构可能由于活化状态是瞬时的,因此很少。在这个失活构象中,F397堆叠在烟酰胺和异别恶嗪环之间(图3d),暗示在催化转换过程中这个氨基酸侧链发生位移。作者进一步分析了在转换条件下结合NADPH的F397A突变体,发现F397A的Km没有很大改变但是Kcat适度增加(原文附图14g),烟酰胺环与异别恶嗪环之间距离变小并与异别恶嗪环成一个~26°角(图3e)。如之前的豌豆FNR Y308突变体,失去F397的大侧链使NADPH在SpNOX中占据有效构象。
图3SpNOX的NADPH结合位点和电子传递路径
寻找潜在的靠近外血红素结合口袋的氧气还原中心揭示了外血红素高度暴露在细胞外区域中,但在其他NOXs中是更埋藏的(图4a)。在SpNOX中,细胞外loop折叠远离血红素腔,使外血红素暴露在溶剂中(图4b,c)。之前描述过的NOXs的相似氧气结合位点在SpNOX中并没有被发现。但是检查外血红素结合口袋后发现了在C-loop下有一个小腔占据着一个水分子,它与N84, N101和 Y105形成了氢键(图4d)。他们还发现了另一个可能的氧气结合位点,占据着一个水分子,由高度暴露于溶剂的S86和与血红素结合的H83构成(图4e)。
图4 SpNOX表现出一个高度暴露于溶剂的外血红素和两个可能氧气结合位点
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研究讨论
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这里测定的底物结合的SpNOX结构揭示了失活构象,为它的催化机制提供相关信息,为NOXs的电子传递通路提供新的见解。SpNOX F397A的转换速率增加表明它类似其他FNR超家族成员,C端芳香残基短暂的位移对进行氢负离子转移是必要的。分子动态模拟会帮助我们对F397位移的理解。SpNOX展现暴露于溶剂中的细胞外区域可能表明存在潜在的接受体蛋白,这体现在SpNOX可以直接还原细胞色素c和SOD。
结构和生化分析揭示SpNOX和真核NOXs具有相似的结构组成和折叠,表明保守的结构基序可能对这个复合物有效行使功能是必要的。未来这个酶的生理功能有待用功能性试验探究。
总结
研究意义
这个研究产生了稳定的蛋白样品,完成大量样本优化,测定了SpNOX的cryo-EM结构,揭示关于催化活性的新的信息以及细菌NOXs和真核NOXs的相似与不同。
参考文献
[1] Dubach, V. R. A., San Segundo-Acosta, P., and Murphy, B. J. (2024). Structural and mechanistic insights into Streptococcus pneumoniae NADPH oxidase. Nat Struct Mol Biol. Advanced online publication. https://doi.org/10.1038/s41594-024-01348-w
END
文案 | Linsey
排版 | Linsey
审核 | Linsey
发布|姜笑南
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