Fig.1INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background共价靶向放射性核素治疗是癌症治疗的一个新兴领域，即放射性药物将强效放射性核素输送到肿瘤并进行局部照射，解决未满足的临床需求，改善癌症患者的预后。目前，治疗的放射性药物在实现可持续的肿瘤靶向并将其快速地从健康组织中清除方面，仍然是一个重大挑战。因此，开发一种有选择性地将放射性药物固定在肿瘤靶蛋白上的靶向结扎策略，将是一种理想的解决方案。（Fig.2）Fig.2　　2024年5月22日，北京大学/昌平实验室的刘志博教授团队，在《Nature》上发表了一篇关于核药物设计的文章，这是《Nature》近50年来发布的首篇放射性核素治疗领域的论文。（Fig.1）研究意义Significance　　研究人员旨在开发一种共价靶向放射性配体(CTR)，由此提出了一种通过硫(VI)氟化物交换(SuFEx)化学基团的链接器来增强放射性药物肿瘤靶向性的方法。　　这种策略能够选择性地将放射性药物固定在肿瘤特异性蛋白上。当改造过的放射性药物与肿瘤特异性蛋白结合时，会经历一个从结合到连接的转变，并通过“点击”SuFEx反应与蛋白质中的酪氨酸残基实现更容易地共轭。（Fig.3）Fig.3      研究结果显示，采用这种方法改造的药物与蛋白质的共价结合率超过80%，且在6天内几乎没有解离。在实验小鼠中，SuFEx改造的药物相比于原始药物，肿瘤吸收率增加了257%，肿瘤保留率提高了13倍。同时，健康组织中的吸收物质能迅速被清除。初步成像研究显示，这种方法能够比其他方法识别出更多癌症患者的肿瘤病灶。　　此外，采用SuFEx技术改造的针对纤维母细胞激活蛋白（FAP）抑制剂（FAPI）和针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的放射性配体，均显示出增强的治疗效果。由于SuFEx弹头可以连接到潜在的广泛蛋白质，因此这种策略可能被扩展应用于其他癌症治疗靶点。METHODS•✦研究方法✦•经典方法1分子对接和分子动力学模拟：使用分子对接软件GOLD和分子动力学模拟软件AMBER研究FAPI与FAP的结合模式。2放射性标记：使用放射性核素68Ga和177Lu对小分子进行放射性标记，用于PET/CT成像和治疗。3体外结合实验：使用竞争性结合实验和SDS-PAGE分析评价FAPI与FAP的结合。4细胞摄取和保留实验：使用荧光标记的小分子，评价FAPI在细胞内的摄取和保留。RESULTS•✦研究结果✦•CTRs增加肿瘤对放射性配体的摄取01　　出于应用广泛性考虑，研究人员选择成纤维细胞激活蛋白(FAP)，作为开发CTR的靶标。CTR设计的一般工作流程如图所示。（Fig.4）Fig.4　　首先使用GOLD软件（一款分子对接程序）确认 FAPI 修饰的起始点。FAP活性位点的微环境，包含高度亲核的Y450和邻近的Y210，由此研究人员的注意力转向了硫(VI)氟交换(SuFEx)潜在弹头，它与多种氨基酸(包括酪氨酸20)表现出反应性。据报道，它们的接近性与反应性赋予了它们在到达目标之前具有高稳定性和生物正交性，这使它们能够用于小分子抑制剂、蛋白质和其他生物分子。　　安装SuFEx后，经构效关系预测选定反应性更高的FAPI-SF(1)，并对其进行了177lu放射性标记。在体外实验中，与FAP孵育后表现出快速且不可逆的共价结合。在荷瘤小鼠体内正电子发射断层扫描和计算机断层扫描(PET/CT)成像显示，装载SF后的FAPI肿瘤摄取明显大于普通FAPI。且清除迅速，主要通过肾脏系统发生，在其他主要器官的积累几乎可以忽略不计。（Fig.5）Fig.5　　这第一次尝试表明共价放射配体策略是有前景的。然而，稳定性实验表明，超过50%的FAPI-SF在磷酸盐缓冲盐水中被水解，这表明SF对此存在过度反应性，导致不理想的脱靶。CTR-FAPIs 与 FAP不可逆结合02　　研究人员随后开始寻找具有较低反应性但更高的体内稳定性和更好的肿瘤靶向性的替代FS弹头。　　合成了两种新的CTR-FAPIs，具有吸电子酰胺取代FS的FAPI-pFS 以及 FAPI-mFS，具有理想的稳定性，并用68Ga或177Lu进行放射性标记。体外试验显示，FAPI-pFS和FAPI-mFS与FAP具有高效且稳定的不可逆共价结合。（Fig.6）Fig.6　　研究人员提出可以通过活性蛋白质组学的方法来识别FAP上的其他潜在反应性氨基酸残基，对现有的次优SuFEx弹头进一步改进，从而开发出与FAP结合更紧密、更不易脱落的SuFEx弹头，提高FAPI的肿瘤靶向性和疗效。　　他们用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）纯化了natLu-FAPI-pFS(其中上标“nat”表示天然或非放射性)或natLu-FAPI-mFS连接蛋白复合物，用于胰蛋白酶裂解，并收集了相应的串联质谱，下图列出具有代表性的修饰残基。　　在SuFEx反应后，Y210和Y450被natLu-FAPI-pFS或natLu-FAPI-mFS修饰为Lu-FAPI-pFS-Y210-FAP和Lu-FAPI-mFS-Y450-FAP配合物。分子动力学(MD)模拟进一步证明了这些连接的稳定性。　　研究人员还在单循环模式下进行了表面等离子体共振(SPR)，进一步对比分子-靶标相互作用动力学。其结合速度以及解离速率均表现出优势。　　对孵育后细胞中提取的总蛋白进行了SDS-PAGE放射自显影分析。所示FAPI-pFS和FAPI-mFS与细胞上的FAP有效且牢固地形成共价键。且共价结合可以有效地增加放射配体的细胞摄取和保留。另外，研究人员还通过外排实验检测FAPI的细胞保留情况。FAPI-pFS和FAPI-mFS的半衰期比FAPI-04的半衰期长13.9倍。（Fig.7）Fig.7　　后续研究人员还合成了荧光探针FAPI-AF488-mFS来辅助验证实验结果，通过可视化细胞摄取和外排，表明SuFEx工程可以增加FAPI及其衍生物的细胞摄取和保留。然而，CTR-FAPIs 是否可以利用肿瘤对FAP靶向放射配体(如FAPI-04)的摄取，从而在动态血液循环的荷瘤小鼠中有效地锚定FAP，至此尚不明晰。PET影像学对比03　　通过其高选择性以及高度亲水性和多电荷螯合剂的作用(例如DOTA)，确认细胞内靶标脱靶的可能性不大。　　还通过人血清和小鼠血液培养以及尿稳定性试验，表明SuFEx工程，特别是mFS，可能不会在健康组织中引起脱靶共价结合。　　在相同的荷瘤小鼠中对[68Ga]Ga-FAPI-04和[68Ga] GA - FAPI - pFS(或[68Ga]Ga-FAPI-mFS)进行了头部PET/CT成像。注射后1小时，[68Ga]Ga-FAPI-pFS和[68Ga] Ga-FAPI-mFS的肿瘤摄取明显高于FAPI-04 ，最大SUV (SUVmax)分别增加92%和257%，且清除是快速的，主要通过肾脏系统进行。体外生物分布显示，[68Ga]Ga-FAPI-mFS的肿瘤摄取明显高于[68Ga]Ga-FAPI-pFS和[68Ga]Ga-FAPI-SF，但主要器官的总体摄取较低。这些结果表明FAPI-mFS可用于后续的TRT。　　将FS水解为硫酸氢制备出FAPI-mHS。[68Ga]Ga-FAPI-04、[68Ga]Ga-FAPI-mHS和[68Ga]Ga-FAPI-mFS的荷瘤小鼠PET/CT成像研究，显示[68Ga]Ga-FAPI-mFS摄取率最高，提示共价结合SuFEx是增加肿瘤摄取的关键。　　且在荷瘤小鼠体内可以观察到肿瘤中FAPI-mFS与FAP的共价结合，这是有希望的临床前数据。在随后的临床研究中，与FAPI-04相比，FAPI-mFS的确在甲状腺髓样癌患者中的PET/CT成像中能够识别出更多的肿瘤病灶。（Fig.8）Fig.8CTR通过提高保留率来增强FAP-TRT04　　在FAPI-mFS治疗的长期药代动力学研究中，[177Lu]Lu-FAPI-04和[177Lu]Lu-FAPI-mFS在荷瘤小鼠中的生物分布，证明了FAPI-mFS在肿瘤中的良好靶向性和滞留性。　　根据生物分布，通过OLINDA软件计算[177Lu]LuFAPI-mFS治疗HT-1080-FAP肿瘤的有效剂量为890 mGy MBq−1。小鼠实验以及肿瘤摄影证实了[177Lu]Lu-FAPI-mFS的明显抗肿瘤作用。这些发现表明，治疗性的 CTR-FAPI 在小鼠中具有良好的耐受性，强调了这种治疗策略的生物学安全性。（Fig.9）Fig.9CTR的适用性05      α-发射器225Ac 是放射性核素治疗的重点研究方向之一，其优越的疗效已在临床得到证实。研究人员研究了FAPI-mFS在靶向225Ac治疗中的潜力。　　通过对来自唾液管癌患者的异种移植物模型(SDC-PDX模型)的免疫组织化学分析以及PET/CT成像，显示FAPI-mFS仍显著增加肿瘤摄取。并且在[225Ac]Ac-FAPI-mFS治疗的PDX小鼠组中观察到明显的肿瘤抑制。（Fig.10）Fig.10　　此外，研究人员还评估了[225Ac]Ac-FAPI-mFS治疗的潜在副作用：　　1、靶向225Ac治疗可在治疗后的最初几天引起急性体重减轻，但小鼠在一周后恢复。康复率可能与治疗剂量有关。　　2、全血细胞计数和血液生化检查显示，225Ac治疗后白细胞和血小板计数下降，这并不严重，是其他放射配体治疗常见的副作用。　　3、血红素和伊红(H&E)染色分析表明，高剂量[225Ac]Ac-FAPI-mFS可能导致肝脏和肾脏急性但可恢复的损伤。　　据报道，在SuFEx反应中可引起不可逆结合的残基包括赖氨酸、酪氨酸和组氨酸，这表明广泛的靶标可能与SuFEx形成共价键。作为概念验证，研究人员将这种CTR策略应用于设计[177Lu]Lu-PSMA-617 (Pluvicto)，其靶向前列腺癌细胞上的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。不出意料，设计出的组合物实验结果与上类似。DISCUSSION•✦研究讨论✦•　　在这项研究中，研究人员发现放射配体的肿瘤靶向性和药代动力学可以通过使用SuFEx工程连接体进行全面优化。实验结果表明，在荷瘤小鼠中，SuFEx工程的小分子偶联物，如FAPI- mFS，与原始FAPI相比，可以在肿瘤积累增加近13倍，其余的通过肾脏系统迅速排出。且试点蛋白口袋筛选表明，活性残基广泛应用于许多临床重要靶标。这一强有力的策略将有望使研究人员和制药行业开发出具有小分子、多肽、适体或抗体片段的肿瘤靶向偶联物。参考文献[1] Cui, XY., Li, Z., Kong, Z. et al. Covalent targeted radioligands potentiate radionuclide therapy. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07461-6PROFILE刘志博北京大学 化学与分子工程学院北京大学 北大-清华生命科学联合中心教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者研究兴趣：1、活体化学及其驱动的蛋白激活及药物释放；2、罕见病的影像诊断探针及临床转化研究；3、中子捕获治疗药物及其辐射生物学效应;4、新型医用核素的生产工艺研究与临床应用。END文案 | 姜笑南排版 | 姜笑南发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background       气候变化正广泛地影响人类健康，尤其是对那些患有神经系统疾病或精神疾病的个体。现有研究揭示了由此引发的复杂且负面的影响，特别是在极端温度适应性和昼夜温差的剧烈变化方面。因此，深入理解和预测未来气候变化对神经系统健康的影响至关重要，这对于促进相关政策制定是必不可少的。       近日，英国伦敦大学学院一项发表于Lancet Neurology的综述指出，气候变化可能会对神经系统疾病患者产生负面影响，加剧患者病情。METHODS•✦研究方法✦•文献研究法Literature Review作者通过对1968年至2023年间全球发表的332篇相关论文进行分析，描述气候变化对19种不同的神经系统疾病的影响，包括中风、偏头痛、阿尔茨海默病、脑膜炎、癫痫等。年度发文量2004年后显著增长2015年，巴黎协定是气候政策中的一个关键事件，为全球温度的安全上升设定了界限。2004年之前，探讨气候变化对神经系统疾病潜在影响的文章数量非常低，之后显著增长。图1. 本个人观点中纳入文章的发表年份地区发文量易受气候影响地区发文少Notre Dame–Global Adaptation Index (ND-GAIN) 脆弱性得分使用了来自45个核心指标的74多个变量，用以衡量自1995年至今182个联合国国家的气候变化脆弱性。在这篇个人视角文章包含的332篇文章中（包括补充材料），有308篇报告了特定国家的数据。红色圆圈表示报告某国家气候变化影响的文章数量。美国和中国发表了最多的与气候和神经精神疾病相关的文章，分别有67篇（美国）和65篇（中国）。大多数其他研究集中在整个欧洲气候变化的影响上。来自南美洲、非洲以及南亚和东南亚国家的文章数量较低，然而这些地区被预测为最容易受到气候变化影响的地区。灰色表示没有可用数据。图2. 具体国家易受气候干扰影响的程度和本个人观点中纳入文章的来源FINDINGS•✦研究发现✦•一、气候变化影响神经系统健康的机制      气候变化具有普遍且系统性的后果。特别是，温度升高通过多种机制对神经系统健康产生影响。一是高温挑战机体将体温保持在一个狭窄范围内的能力，这对于维持生命重要功能至关重要。体温调节是一个复杂的生理过程，它需要平衡体内产生的热量和通过不同机制散发到环境中的热量。在极端高温环境下，这种平衡被打破，可能导致严重的健康问题。二是高温直接影响分子层面的功能，尤其是离子通道的功能。在神经系统中，信号和通信的基本特性需要离子通道门控以响应电化学刺激。构成离子通道打开和关闭基础的构象转变（其平衡决定离子通量）通常急剧地依赖于温度。主动跨膜转运对温度也有很高的敏感性。高温对离子通道、突触和轴突功能的直接温度效应导致神经系统并发症的程度尚不完全清楚。对于大多数疾病而言，其潜在机制尚未得到充分研究，但基于目前对人体如何受热影响的理解，气候变化相关驱动因素（如，更高的温度）与病理生理学的产生或破坏之间存在合理的联系。二、气候变化与神经系统疾病的关联性研究1.中风       气候变化对中风的影响尤为显著，特别是在中低收入国家，与中风相关的残疾负担日益加重。此外，老年人群由于多种因素如感知温度能力下降、体温调节问题以及慢性疾病和药物使用等，对气候的变化更为敏感。       研究显示，气候变化可能会增加中风的发生风险及其后果，但现有的数据呈现出复杂且双向的趋势：一些研究指出高温和湿度极端化会增加缺血性中风的发病率，而其他研究则发现低温与中风入院率上升有关。总体而言，环境温度升高、热浪以及昼夜温差或极端温度的变化似乎都与中风的风险增加有关，特别是在寒冷的天气或持续低温条件下。此外，气温上升还可能进一步提高中风后的死亡率和再次发病的风险。2.偏头痛       气温升高与偏头痛的发作之间存在关联。既往一项研究显示，环境温度每上升5°C，患者因偏头痛入院的风险增加7%-15%。此外，气温的波动不仅影响偏头痛的发作，还与其严重程度、持续时间和发作频率有关。然而，现有的研究通常规模有限，并且可能没有充分考虑其他天气因素，如日照和污染，这些因素在气候变化的背景下可能会加剧。总体而言，气候条件的恶化（包括气温升高、极端天气模式和污染加剧）可能会导致两种类型的影响：已经患有偏头痛的人发病频率增加，以及偏头痛的总体发病率激增。3.阿尔茨海默病      患有痴呆症的人对极端天气的危害特别敏感，这可能是因为他们的认知障碍限制了他们适应环境变化的能力。此外，这种敏感性可能因为身体虚弱、多病状态以及精神药物的使用而进一步加剧。研究显示，较大的温度变化、炎热的天气和热浪都可能导致与痴呆症相关的住院和死亡率增加。然而，影响是复杂的，可能是双峰的，并受当地因素影响。4.脑膜炎       识别对气候敏感的传染病对于减轻未来流行病和大流行的影响至关重要。由于迁移、社会动荡、饥荒、战争和城市化，气候变化的社会人口后果将影响许多感染的发生率，这些问题还因卫生设施、清洁水源、营养和医疗保健供给的既有不足和加剧的不足而复杂化。将全球脑膜炎数据与温度变异性（即与最低脑膜炎发病率相关的最大局部温度和观察到的绝对最大局部温度之间的差异）结合显示，温度变异性每增加一个对数单位，全球脑膜炎风险增加4.8%；低碳排放情景将与未来显著降低的脑膜炎发病率相关。5.癫痫       大多数癫痫都可能因气候变化而加剧，如对睡眠剥夺的敏感性，在大多数气候变化情景下，引起或加重癫痫发作或癫痫的感染范围可能会扩大。大多数关于癫痫的研究都是小规模的或轶事式的。数据显示了一种双峰关系。与较冷的天气相比，热浪和较暖的天气都与发热性惊厥或癫痫的住院率增加有关；其他研究报告称低温增加了急诊室就诊的风险，或者关联可以忽略不计。较高的相对湿度和较低的大气压力也与增加的发作风险相关。       此外，气候变化还对多发性硬化、精神障碍等多种神经系统疾病具有复杂的影响。DISCUSSION•✦研究讨论✦•总结与展望Conclusions and future direction 全球变暖对神经系统疾病的管理提出了新的挑战。患者可能需要改变自我管理策略，如采用新疗法、避免炎热天气下锻炼、增加水分摄入以及调整活动节奏以应对疲劳。这些适应性行为及其背后的心理、人际和情绪调节技巧对于减轻气候变化对神经系统健康的负面影响至关重要。同时，护理与医疗专业人员也需改进对患者的支持与管理方法。因此，有效应对这一挑战需要为患者、其家属、护理人员及健康和社会护理系统内提供者设计和实施综合的干预措施。为了更科学地应对气候变化对神经系统的潜在影响，开发精准、系统的疾病导向模型变得至关重要。这些模型将提供对未来气候模式及其对神经系统影响的预测，随着对当地温度和湿度变化的理解逐步深入，对应的健康预测模型也需要进一步细化，确保其预测结果能够针对神经系统疾病患者的个性化需求，为他们提供直接且实用的信息。参考文献Sisodiya SM, Gulcebi MI, Fortunato F, et al. Climate change and disorders of the nervous system. Lancet Neurol. 2024;23(6):636-648. doi:10.1016/S1474-4422(24)00087-5PROFILESanjay M Sisodiya伦敦大学学院Queen Square神经科学研究所临床与实验癫痫学部       一位专注于复杂癫痫的临床科学家。他的博士学位是癫痫的定量成像，在他的整个职业生涯中，他一直从事临床工作，这使他的工作以临床为导向。他在临床上看到的大多数人都患有难以治疗的癫痫，除了癫痫发作外，还有许多合并症。他对这些疾病的遗传学和精准治疗方法感兴趣。     他领导或参与了大型国际财团，如EpiPGX、ENIGMA-Epilepsy和Epi25，以新的、强有力的方式推动研究议程。最近，他正在研究气候变化将如何影响癫痫。END文案 | 刘涛排版 | 刘涛审核 | 夏诞发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

最新消息5月21日，根据国家药品监督管理局（NMPA）官网公示，礼来公司递交的替尔泊肽注射液获得批准上市。是目前首个且目前唯一的单分子双受体激动剂降糖药物。基本信息商品名：穆峰达（穆峰达®名字源于世界第一高峰珠穆朗玛峰）适用症：适用于在饮食控制和运动基础上，接受二甲双胍和/或磺脲类药物治疗血糖仍控制不佳的成人2型糖尿病（T2DM）患者。作用机理：一种GIP/GLP受体激动剂，它通过选择性地结合并激活葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）和胰高血糖素样肽1（GLP-1）受体来发挥作用。它包含C20脂肪二酸部分的氨基酸序列，能够结合白蛋白并延长半衰期。药效学：替尔泊肽可通过影响食欲减少热量摄入，降低体重，减少更多脂肪。在二型糖尿病患者中进行的研究表明，替尔泊肽可增加胰岛素敏感性。替尔泊肽以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛素分泌，减少胰高血糖素分泌。剂量：每周一次，一天中的任何时间服用，随餐或不随餐服用规格：2.5 mg:0.5ml，5 mg:0.5ml，7.5 mg:0.5ml，10 mg:0.5ml主要不良反应：胃肠道反应和低血糖临床情况本次获批主要基于在T2DM患者中开展的全球关键III期注册试验SURPASS 1-5及亚太地区关键III期注册试验SURPASS-AP-Combo（83.4%的受试者为中国患者12）。SURPASS-213纳入的T2DM患者基线平均糖尿病病程为8.6年、平均HbA1c为8.28%、平均体重为93.7kg、平均体质指数（BMI）为34.2kg/m2。其中，穆峰达® 5 mg、10 mg治疗组受试者第40周时HbA1c较基线的平均降幅为2.09%、2.37%，司美格鲁肽1mg组HbA1c平均降幅为1.86%。此外，体重自基线的平均变化是关键次要终点之一，穆峰达® 5mg、10mg受试者体重平均降低7.8 kg、10.3 kg，司美格鲁肽1mg组平均降低6.2kg。SURPASS-AP-Combo12纳入的T2DM患者基线平均糖尿病病程为7.7年、平均HbA1c为8.71%、平均体重为76.6kg、平均BMI为27.9kg/m2，47.5%的受试者基线时使用磺脲类药物。其中，穆峰达® 5mg、10mg治疗组受试者第40周时HbA1c较基线的平均降幅为2.24%、2.44%，甘精胰岛素组HbA1c平均降幅为0.95%。此外，体重自基线的平均变化是关键次要终点之一，穆峰达® 5mg、10mg受试者体重平均降低5.0 kg、7.0kg，甘精胰岛素组体重平均增加1.5kg。中国临床试验登记情况单药治疗2型糖尿病（CTR20232036）、超重和肥胖成人中降低心血管风险（CTR20223054）已完成患者招募。阻塞性睡眠呼吸暂停和肥胖（CTR20222427）适应症的临床研究已完成研究。市场情况替尔泊肽在美国已于2022年5月获得FDA批准，用于与控制饮食和锻炼联用，改善成人2型糖尿病患者的血糖控制。此外，替尔泊肽的减重适应症也在2023年11月获得FDA批准，用于肥胖或伴有体重相关并发症的超重患者的体重控制。已在中国、美国、阿拉伯联合酋长国、欧盟、日本等多地获批用于成人T2DM患者的血糖控制。在中国市场，替尔泊肽的上市将与诺和诺德的司美格鲁肽等其他药物进行竞争。预计该药物将于2024年四季度正式商业上市，具体定价将在上市时公布。参考资料[1] 替尔泊肽美国说明书[2] 礼来新闻稿：重磅 |礼来穆峰达®（替尔泊肽注射液）获批！END文案 | 石墨排版 |石墨审核 | 夏诞发布｜姜笑南

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background　　随着精准医疗领域的革命性进展，临床上可操作和病原性的基因突变的识别已经取得了巨大的进步。然而，在已报告的7.87亿个基因变异中，只有不到0.5%的变异在ClinVar数据库中有临床解释。由于大多数变异是罕见或特定于特定人群的，使用全基因组关联研究或计算方法来预测其功能影响变得特别具有挑战性。此外，基因变异的共现进一步复杂了现有计算方法的解释。在这些情况下，全基因组关联研究难以准确确定个体变异是病原性的还是仅仅作为乘客突变共遗传的。这种情况下，亟需在基因编辑领域开发工具，以便在相同的基因背景下建模多个基因变异组合，从而分解多基因障碍、意义不明确的变异组合、单倍型块中遗传的变异或在相同生物通路中修饰基因内的变异的临床贡献 。　　2024年5月21日，加州大学圣地亚哥分校Alexis Komor教授团队在《NatureBiotechnology 》上发表了相关研究的最新文章。研究意义Significance      本研究开发了一种多重正交碱基编辑系统（MOBE），该系统通过使用RNA适配体-外壳蛋白系统将DNA修饰酶直接招募到导向RNA，从而实现了腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器的正交多重化。MOBE系统能够在不同的原位上同时引入C·G到T·A和A·T到G·C的单核苷酸变异，具有较高的精确度和编辑效率。通过荧光富集策略，MOBE系统在多种细胞类型中实现了高达24.8%的同时编辑率。这一系统不仅兼容扩展的原位旁邻基序和高保真Cas9变体，还在多个细胞类型中表现良好，且与其原始系统相比具有相同或更低的脱靶倾向。MOBE系统的开发为研究多基因障碍、意义不明确的变异组合以及疾病相关的点突变组合提供了新的工具。METHODS•✦研究方法✦•RNA适配体技术利用RNA适配体-外壳蛋白系统，将DNA修饰酶直接招募到导向RNA上。这一方法用于设计和优化腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE），确保它们能够在不同位点同时进行编辑，避免交叉编辑的问题 。荧光报告基因系统设计了一个包含双死GFP基因的荧光报告系统，用于检测和富集高编辑效率的细胞。通过荧光活性细胞分选（FACS），提高了编辑效率，并确保了编辑的准确性 。次世代测序（NGS）通过NGS技术，对编辑效率和精确度进行了量化分析。NGS数据用于评估目标位点的编辑效率、交叉编辑率以及插入/缺失（Indel）率。FINDINGS•✦研究发现✦•1多重正交碱基编辑系统（MOBE）的设计与实现图1图a概述了碱基编辑的基本原理，以胞嘧啶碱基编辑器（CBE）为例，说明如何通过导向RNA（gRNA）和催化失活的Cas9（nCas9）形成R-loop结构，暴露出一个小窗口以进行精准的碱基修改。接着，图b展示了同时使用CBE和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）进行多重编辑时，因gRNA交叉绑定导致的非正交编辑问题。图c则示意了这种交叉编辑可能带来的多种基因型变化。最后，图d提出了利用正交适配体-外壳蛋白系统解决交叉编辑问题的方法，通过将脱氨酶直接招募到各自的gRNA上，实现特定位置的C·G到T·A和A·T到G·C编辑，确保了编辑的特异性和精确性。这些图示展示了MOBE系统如何通过创新设计，实现高效、精准的多重正交碱基编辑，为复杂基因变异的研究提供了新的工具。（图1）2腺嘌呤碱基编辑器（ABE）适配体系统的工程化　    研究人员通过设计和测试多种gRNA适配体和脱氨酶融合蛋白组合，显著提高了ABE的编辑效率。首先，实验展示了初始设计的ABE适配体系统在编辑效率上的低效和可变性。随后，通过采用进化的脱氨酶TadA8e和TadA8.20，研究团队成功优化了ABE适配体系统，实现了较高的A·T到G·C编辑效率。最终，图展示了多个适配体-脱氨酶组合在不同基因位点的编辑效果，证明了这些优化系统在提高编辑效率和精确度方面的显著改进 。（图2）图23胞嘧啶碱基编辑器（CBE）适配体系统的工程化　　研究人员通过设计和测试多种gRNA适配体和脱氨酶融合蛋白组合，显著提高了CBE的编辑效率。首先，图a概述了嵌入适配体的gRNA和脱氨酶-外壳蛋白（CP）融合蛋白的构建。图b和图c分别展示了在HEK3和RNF2基因座上，使用evoAPOBEC1脱氨酶和MS2适配体-CP系统的CBE适配体系统的编辑效率。实验结果显示，前七种构建体在目标胞嘧啶的C·G到T·A编辑效率最高。图3d展示了在五个基因座（HEK3、EMX1、RNF2、HEK2和HIRA）上，相对于父本evoBE4编辑器，前七种CBE适配体系统的相对编辑效率。最终，图e示意了两个最有效的适配体嵌入gRNA和脱氨酶-CP融合蛋白构建体（apt-CBE-3′-end和apt-CBE-SL3），这些构建体在所有测试位点上表现出一致的高编辑效率 。（图3）图34对优化后的CBE和ABE适配体系统进行了表征　    研究人员在HEK293T细胞中对四种优化的适配体系统和各自的父本编辑器在73个胞嘧啶和112个腺嘌呤上的编辑效率进行了测量，这些靶点分布在15个不同的基因组原位上。图a和b展示了目标胞嘧啶和腺嘌呤在原位内各位置的编辑效率，并根据其前5′碱基的不同进行颜色区分。实验结果显示，所有四种适配体系统的编辑窗口略窄于其父本编辑器。图c和d则将每种适配体系统的最高编辑效率标准化为其父本编辑器，结果表明，适配体系统在所有15个原位中的编辑效率具有一致性和高效性。（图4）图45MOBE和BE在同时使用CBE和ABE时的分析研究人员设计了四种MOBE系统，每种系统结合了优化后的CBE和ABE适配体。通过在HEK293T细胞中进行实验，结果表明MOBE系统在目标位点的编辑效率显著提高，且交叉编辑显著降低。具体来说，MOBE1系统在HIRA.0/HEK3.0位点的C·G到T·A转换效率为21.8%，A·T到G·C转换效率为36.2%。相比之下，其父本evoBE4/ABE8e系统分别为16.8%和49.0%。MOBE系统的交叉编辑率明显低于父本系统，MOBE3系统在所有原位上的交叉编辑平均仅为1.0%，而evoBE4/ABE8e系统的交叉编辑率高达30.2%。这些结果展示了MOBE系统在多重正交编辑中的高效性和低交叉性，为精确基因编辑提供了新的工具 。（图5）图56利用荧光报告基因系统增强MOBE效率研究人员设计了一个包含双死GFP基因的报告系统，当MOBE系统成功执行A·T到G·C和C·G到T·A编辑时，会恢复GFP的荧光。HEK293T细胞被转染了MOBE系统、目标gRNA和报告质粒。通过荧光活性细胞分选（FACS），富集了高编辑效率的细胞。结果显示，MOBE1系统在六个原位组合中平均达到了40.0%的C·G到T·A和55.7%的A·T到G·C编辑效率，最高达到81.5%。富集细胞的编辑效率显著高于未富集细胞，且富集策略未降低正交性。实验还发现，MOBE系统的插入/缺失（Indel）率较低，确保了编辑的精确性和安全性 。（图6）图6DISCUSSION•✦研究讨论✦•　    本文开发了多重正交碱基编辑系统（MOBE），展示了在多个基因位点同时引入单核苷酸变异的高效和精确能力。研究发现MOBE系统能够在不同的细胞类型中实现高达24.8%的精确共现编辑率，并且具有较低的脱靶效应，这为研究多基因障碍和疾病相关的点突变组合提供了新的工具。研究展示了如何通过分子生物学技术和基因编辑工具的创新组合，实现复杂的基因编辑任务，从而推进精准医疗的发展。       尽管研究成果显著，但本文也有一些局限性。首先，虽然MOBE系统展示了较高的编辑效率，但在某些目标位点上的效率仍有提升空间。此外，尽管脱靶效应较低，但在临床应用前，还需要进一步验证其在体内的安全性和稳定性。最后，该系统的复杂性可能对实验室的普及和应用带来一定的挑战。参考文献[1] Cowan, Q.T., Gu, S., Gu, W. et al. Development of multiplexed orthogonal base editor (MOBE) systems. Nat Biotechnol (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02240-0 [2] A New Gene-Editing System Tackles Complex Diseases (https://today.ucsd.edu/story/mobes)PROFILEQuinn T. CowanDepartment of Chemistry and Biochemistry, University of      California San Diego, La Jolla, CA, USA“我们正在将质粒放在 AddGene 上，以便任何人都可以自由访问它们。我们希望其他研究人员能够使用 MOBE 来模拟遗传疾病，了解它们的表现，然后希望创造出有效的疗法，”Cowan 说。END文案 | 贺卫军排版 | 贺卫军审核 | 夏诞发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

图1INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background　　人类肠道内存在大量真菌，被称为肠道真菌群落(gut mycobiome)。尽管其数量只占肠道微生物的很小一部分，但肠道真菌对各种生理和病理过程有重要影响。　　一直以来，肠道真菌的参考基因组数据库的缺乏，限制了对肠道真菌种群组成的高通量测序数据的准确定量，也限制了使用转录组学和蛋白质组学对肠道真菌进行深入研究。研究意义Significance　　该研究通过大规模培养和基因组测序，建立了一个包含760个基因组的培养肠道真菌(CGF)目录，该目录显著增加了肠道真菌物种和蛋白质家族的基因组资源。　　此外，还通过将CGF目录与公开可用的人类相关真菌(PHF)基因组资源结合起来，对来自中国人群和非中国人群的肠道真菌组进行了分析。鉴定出疾病共有和特异性肠道真菌特征，并通过动物实验进一步阐明它们与IBD的关联。　　这种广泛的CGF资源为人类肠道菌群的生物学意义提供了新的见解，为未来的研究和应用提供了宝贵的资源和方法，有望刺激该领域未来的实验研究。（图1）METHODS•✦研究方法✦•1菌株培养和基因组测序：研究人员从健康志愿者的粪便中培养出760株肠道真菌，并对其进行全基因组测序，建立了肠道真菌培养物（CGF）目录。这些基因组为后续研究提供了宝贵的资源，揭示了肠道真菌的遗传多样性和功能潜力。2功能基因组学分析：对760个CGF基因组进行功能分析，预测了大量的蛋白质编码基因和次级代谢基因簇，揭示了肠道真菌的代谢潜能和功能多样性，有助于理解其对肠道环境的适应机制。3靶向代谢组学分析：对199个CGF物种进行体外代谢组学分析，鉴定了241种初级代谢产物，包括脂肪酸、氨基酸、有机酸等，揭示了不同亚门肠道真菌的代谢特征。4粪便宏基因组测序：收集并分析了超过11,000个粪便宏基因组数据，包括中国人群（28种疾病或亚健康状态）和非中国人群（多种国家），揭示了肠道真菌群落与疾病状态的关系，发现了一些与疾病相关的真菌特异性标志物。5动物实验：通过动物实验验证了某些肠道真菌对炎症性肠病的发生有促进或抑制作用，为研究肠道真菌在疾病中的作用机制提供了实验依据。RESULTS•✦研究结果✦•一、肠道真菌的培养和基因组测序　　研究人员使用多种真菌特异性培养基从135名健康志愿者的新鲜粪便标本中培养真菌。总共获得760个组装基因组，形成完整性较高的CGF目录。在新测序的物种中，58个隶属于已知属，而其余11个根据其ANI值(平均核苷酸 identity，来区分肠道真菌的物种)和与已知真菌的系统发育关系被分类在科或更高的分类水平。　　在CGF中，确定了三个主要的真菌门:子囊菌门，担子菌门和毛霉门。丝状子囊菌属的曲霉属、青霉属、踝节菌属在CGF目录中占主导地位。其他显著的真菌类群包括典型酵母菌(酵母菌亚门)，如念珠菌和毕赤酵母。　　值得注意的是，69个新测序的物种广泛分布在不同的分类分支中，这表明NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库中可能还有其他来自人类的未培养物种。结果表明，此次CGF目录显著增加了可培养肠道真菌的数量，部分分属中的大多或所有物种都在CGF中被完全鉴定出来。此外，高比例的CGF物种被发现与从动物和自然栖息地分离的可用NCBI基因组共享，表明外部环境和人类肠道之间存在潜在的真菌交换。（图2）图2二、CGF基因组的功能结构　　检测出的CGF基因组编码蛋白质，使人类肠道真菌已知蛋白质序列多样性增加了247%，突出了CGF目录中蛋白质编码内容的相当新颖性。eggNOG是一个生物信息学数据库，用于存储和查询基因的进化信息。eggNOG图谱的主坐标分析(PCoA)显示了四个真菌亚门之间的明显分离:子囊菌门，担子菌门、毛霉门和酵母菌门。KEGG是“京都基因与基因组百科全书”（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes），提供了一个平台，用于集成和分析来自基因组、化学和系统生物学的各种数据。对于760个CGF基因组中的每一个，基于KEGG模块的完整性比率重构了核心功能通路。　　功能配置分析显示，不同真菌亚门在功能配置上存在显著差异，与它们的生态位适应密切相关。（图3）图3三、真菌基因在肠道环境适应中的功能　　可发酵底物(即多糖、蛋白质和脂质)的降解和次生代谢物的生物合成的功能可能在真菌对人类肠道环境的生态适应中发挥关键作用，研究人员试着探索促进这些适应的潜在基因库。　　首先是碳水化合物活性酶（CAZymes）分析：共预测到532,809个CAZymes，占CGF物种总蛋白库的0.9%-9.3%。其中，Pezizomycotina物种编码的CAZymes比例显著高于其他真菌类群。这些真菌表达大量植物细胞壁降解酶（PCWDEs），能够降解纤维素、半纤维素、淀粉和果胶。　　接着是蛋白酶和脂肪酶基因分析：在CGF基因组中检测到225,078个蛋白酶基因和188,425个脂肪酶基因，分别占CGF物种总蛋白组的1.3%-4.1%（平均2.9%）和0.2%-4.3%（平均2.3%）。Pezizomycotina物种表现出比其他亚门更高的脂质降解能力，而Saccharomycotina物种则表现出显著的蛋白水解能力。　　以及次级代谢基因簇（SMGCs）分析：在CGF基因组中总共发现了22,762个SMGCs。Pezizomycotina基因组中SMGCs的比例最高，其中92.7%的SMGC家族是独特的。这些SMGC家族主要被单个物种（45.3%）或属（67.6%）编码。　　以上，真菌基因在碳水化合物、蛋白质和脂质代谢以及次级代谢中的功能，可能有助于真菌在肠道环境中的生态适应。（图4）图4四、初级代谢产物的体外表征　　研究人员对199个肠道真菌物种进行了体外靶向代谢组学分析，以表征这些物种产生的初级代谢产物。他们测量了冻干真菌粉末中的241种初级代谢产物，包括56种脂肪酸及其衍生物、55种氨基酸及其衍生物、33种有机酸、26种碳水化合物和25种苯类化合物。　　结果表明，在216种最丰富的代谢产物中，有166种在四个子门（Mucoromycota、Pezizomycotina、Saccharomycotina和Basidiomycota）之间显示出显著的浓度差异。Pezizomycotina富含各种氨基酸、苯类化合物、碳水化合物和有机酸，Saccharomycotina富含其他氨基酸和脂肪酸，Basidiomycota则富含某些有机酸。PCoA分析显示，真菌子门之间初级代谢产物的谱线有显著的分歧，暗示它们在肠道环境中的生态适应和潜在的生理作用。五、参考基因组绘制肠道真菌图谱　　由于直接将reads映射到真菌基因组存在困难，研究人员从最近开发的用于超低丰度细菌高精度定量的算法中获得灵感，开发了一种新的算法，该算法同时考虑了reads与真菌物种特异性基因和共享基因的对齐，可以实现高精度的真菌宏基因组定量。　　在真菌基因组参考数据库的基础上，利用定量工具，旨在探索肠道真菌群落的特征及其与常见疾病的潜在联系。通过对6756个中国人群的粪便宏基因组样本和6188个非中国人群的样本进行分析，研究人员能够从宏基因组数据中准确地定量各种真菌物种的相对丰度。　　基于算法对宏基因组数据的分析结果，研究人员绘制了不同人群和疾病状态下的肠道真菌图谱。他们能够识别出与健康状态和各种常见疾病相关的真菌组成差异。六、共享的和特定疾病的肠道真菌特征　　研究人员收集并分析了超过11,000个粪便宏基因组样本，覆盖了28种疾病或亚健康状态的中国人群以及多种国家的人群。通过比较疾病组和对照组，研究人员识别出522个独特的肠道真菌差异特征，包括109个科级、171个属级和242个种级特征，这些特征与多种疾病相关。（图5）图5　　通过动物实验验证了某些与炎症性肠病相关的肠道真菌对小鼠结肠炎的影响，结果表明，一些真菌（如念珠菌属和马拉色菌属）在多种疾病中富集，而其他有益的微生物则减少。此外，研究人员还发现了一些疾病特异性的肠道真菌特征，这些特征在不同疾病中表现出不同的丰度模式。例如，白色念珠菌在多种疾病中显著富集，而与炎症性肠病相关的特征则在小鼠实验中显示出促进或缓解结肠炎的能力。（图6）图6DISCUSSION•✦研究讨论✦•　　目前的CGF集及其相应的基因组和代谢组数据集代表了一种很大程度上未开发的资源，可用于进一步研究人类肠道菌群的生态学和功能。       研究人员提到：未来的研究应侧重于设计新的方法来利用肠道菌群的潜力，例如从不同的食物来源中提取营养，与细菌微生物群合作或竞争，以及保护宿主免受潜在疾病的侵害等。参考文献[1] A genomic compendium of cultivated human gut fungi characterizes the gut mycobiome and its relevance to common diseases. Yan, Qiulong et al. Cell, Volume 0, Issue 0PROFILE马骁驰：大连医科大学药学院教授Francis M. Martin：法国农业科学研究院（INRA）院士果德安：中国科学院上海药物研究所研究员王超：大连医科大学药学院教授END文案 | 姜笑南排版 | 姜笑南审核 | 夏诞发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展