INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background随着肿瘤免疫治疗的兴起，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的异质性及其在肿瘤微环境中的关键作用日益受到关注。TAMs 可分为促炎型（M1）和抗炎型（M2）两种表型，它们在肿瘤发生发展、免疫抑制和免疫逃逸中扮演着截然不同的角色。M1 型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，启动和维持炎症反应，清除病原体和肿瘤细胞，促进免疫细胞的募集和活化，抑制肿瘤生长和转移。M2 型巨噬细胞具有促肿瘤活性，抑制炎症反应，促进血管生成和组织修复，抑制免疫细胞的募集和活化，促进肿瘤生长和转移。M1 型巨噬细胞受到促炎因子如 LPS 和 IFN-γ 的刺激后，会诱导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，进而催化 L-精氨酸转化为 NO。因此，M1 型巨噬细胞会产生大量的 NO。M2 型巨噬细胞受到抗炎因子如 IL-4 的刺激后，iNOS 的表达会被抑制，因此其不会产生或仅产生少量的 NO。因此，可以通过检测巨噬细胞中NO的含量来鉴别不同极化状态的巨噬细胞。现有的 NO 探针大多存在光稳定性差、光损伤等问题，且多为单一成像模式，易受环境干扰和自荧光影响。为了克服传统方法的局限性，中山大学研究团队开发了一种新型的线粒体靶向型双光子铱配合物磷光探针 Ir-ImNO 用于实时、准确地监测 TAMs 的极化状态。研究亮点Objectives理性探针设计：Ir-ImNO 探针分子以铱配合物为发光母体，引入N5-苄基-1,10-菲罗啉-5,6-二胺 (BPDA) 作为识别NO的响应基团。当 NO 存在时，BPDA 会与 NO 发生反应，形成新的三唑化合物，导致 Ir-ImNO 探针分子结构的改变，继而影响 Ir-ImNO 探针分子的能量跃迁过程，导致磷光强度和磷光寿命的变化。（图1）图1 探针的结构和应用高灵敏度、高选择性： Ir-ImNO 对 NO 具有极高的灵敏度和选择性，能够检测低浓度的 NO，检测限低至 14 nM，并排除其他生物活性物质或离子的干扰。多模态成像能力： Ir-ImNO 可用于单光子显微镜、双光子显微镜和磷光寿命成像等多种成像模式，从而实现对 TAMs 极化状态的全面监测。线粒体靶向能力： Ir-ImNO 能够特异性地靶向细胞线粒体，从而更精确地检测细胞线粒体内 NO 的变化。良好生物安全性： Ir-ImNO 对细胞和红细胞均无毒性，具有良好的生物安全性。FINDINGS•✦研究发现✦•1.多模态成像分析TAMs 极化状态研究人员利用 Ir-ImNO 探针，成功地对细胞和活体小鼠中的 TAMs 极化状态进行了多模态成像分析。利用磷光强度成像技术，研究人员发现，LPS/IFN-γ 诱导的 M1 型巨噬细胞会产生强烈的橙黄色磷光信号，而 IL-4 诱导的 M2 型巨噬细胞则产生十分微弱的磷光信号。（图2）图2 利用磷光强度成像技术鉴别M1和M2巨噬细胞利用磷光寿命成像技术，研究人员观察到 M1 型巨噬细胞发出绿色的伪色信号（610 ns），而 M2 型巨噬细胞则发出黄色的伪色信号（867 ns）。这种颜色信号差异是由于磷光寿命的差异造成的，从而可以更直观地区分两种表型的巨噬细胞。（图3）图3 利用磷光寿命成像技术鉴别M1和M2巨噬细胞上述结果表明，Ir-ImNO 能够有效地识别和区分 M1 和 M2 表型的 TAMs，并通过磷光强度和磷光寿命的变化反映其极化状态以及免疫反应状态。2.监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响Ir-ImNO 还可用于监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响，从而评估其免疫治疗效果。研究人员利用 Ir-ImNO 探针监测了 FLT3 受体酪氨酸激酶抑制剂 Pexidartinib (PLX3397) 对 TAMs 极化状态的影响，发现 PLX3397 能够促进 TAMs 从促瘤型 M2 表型转化为抑瘤型 M1 表型，从而抑制肿瘤生长。（图4）图4 探针监测免疫治疗药物对 TAMs 极化状态的影响DISCUSSION•✦研究讨论✦•本研究开发了一种新型的线粒体靶向型双光子铱配合物磷光探针 Ir-ImNO，并利用其实现了对巨噬细胞极化状态的精准“追踪”。该探针具有高灵敏度、高选择性、多模态成像和生物安全性等优势。Ir-ImNO 探针的开发为 TAMs 极化状态的监测提供了一种新的工具，有助于深入理解肿瘤免疫机制和评估免疫治疗效果。未来，Ir-ImNO 探针有望在肿瘤免疫治疗领域发挥重要作用，并为开发新型免疫治疗药物提供理论依据。参考文献[1] Yuxin Wen,Xianbo Wu,Weijun Wu, Tao Feng, Yihang Pan, Yulong He, Liangnian Ji,and Hui Chao. A Mitochondria-Targeted Nitric Oxide Probe for Multimodality Imaging of Macrophage Immune Responses.  Anal. Chem. 2024, 96, 6666−6673.END文案 |陆细刚排版 | 陆细刚审核 | 陆细刚发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background小细胞肺癌（SCLC）约占肺癌病例的15%并且预后不良，大约2/3的患者处于广泛期（ES）疾病状态，5年总存活率只有1-5%。免疫检查点抑制剂结合以铂为主的化疗方案已经报道和延长的中位生存期有关。贝莫苏拜单抗是一种人源的抗PD-L1抗体，已经展现出和其他免疫检查点抑制剂相似的临床前抗肿瘤活性。安罗替尼与免疫检查点抑制剂有潜在的协同作用。有一项1b期剂量递增试验探究了安罗替尼和贝莫苏拜单抗结合展现了良好的安全性，并且6个ES-SCLC患者中有4个得到部分反应。研究目的Aim探究化疗方案中加入贝莫苏拜单抗和安罗替尼是否能够在ES-SCLC的一线治疗展现协同效应以及化疗方案中只加入安罗替尼是否临床有益。METHODS•✦研究方法✦•1ETER701 (NCT04234607) 是在中国72个地点进行的多中心双盲双模拟随机化安慰剂对照三期临床试验。所有有资格的病人被中央随机分配以1:1:1的比例接受以下三个治疗方案之一：1. 贝莫苏拜单抗+安罗替尼+依托泊苷/卡铂（EC），随后贝莫苏拜单抗和安罗替尼维持治疗；2. 贝莫苏拜单抗安慰剂+安罗替尼+EC，随后安罗替尼维持治疗；3. 贝莫苏拜单抗安慰剂+安罗替尼安慰剂+EC，随后安慰剂维持治疗。随机化方法是中央分层随机化。治疗分配屏蔽患者、他们的家人或者监护人、研究者、本地和中央放射学审查员，研究统计学家、参与数据清理和数据分析的数据管理人员、研究赞助人直到最终的数据库被锁定。中期分析是由独立的数据监察委员会以非盲方式进行的。2ETER701试验评估两个主要有效性终点：无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。独立评审委员会（IRC）根据RECIST 1.1评估PFS，定义为从随机化到第一次记录疾病或死亡的时间。OS定义为从随机化到死亡的时间。次要终点包括IRC根据RECIST1.1评估的客观应答率，定义为实现完全应答和部分应答的参与者比例。生存分析用Kaplan–Meier方法，用分层log-rank检验。风险比（HR）和相关95%置信区间（95%CIs）用分层Cox比例风险模型评估。治疗组之间应答率的差异用Cochran–Mantel–Haenszel检验评估。3EQ-VAS问卷评估健康相关生活质量（HRQoL）。混合模型重复测量方法用来比较EQ-VAS从基线的变化。FINDINGS•✦研究发现✦•1.  病人和治疗图1 患者处置1005个病人进行了资格评估。738个病人随机接受治疗（意向治疗人群）。246个病人被分配接受贝莫苏拜单抗+安罗替尼+依托泊苷/卡铂（EC），245个接受安罗替尼+EC，247个接受EC（图1）。在738个患者中736人接受至少一剂方案治疗（安全人群）。在完成诱导治疗后，三组中214、208、208个患者分别接受计划的维持治疗。计划的总生存期中期分析中有89个病人仍处于指定的治疗中（图1）。2. 主要终点OS图2 意向治疗人群的OS在预先指定的OS中期分析中，贝莫苏拜单抗+安罗替尼+EC组病人的中位OS大于EC组（19.3个月（95%CI 14.2-不可估计）vs 11.9个月（95%CI 10.7-13.4）；P=0.0002；风险比0.61（95%CI 0.47-0.79）），满足统计学显著性预先指定的标准（图2）。安罗替尼+EC组的OS和EC组的没有显著差异（13.3个月（95%CI 11.1-15.1）vs 11.9个月（95%CI 10.9-13.4）；风险比0.86（95%CI 0.67-1.10; P=0.1723））（图2）。PFS图3 意向治疗人群的PFSPFS是由独立评审委员会（IRC）根据 RECIST 1.1评估的。在PFS的预先指定的最终分析中，贝莫苏拜单抗+安罗替尼+EC组的PFS显著比EC组的长（6.9 个月（95% CI 6.2–8.3）vs 4.2 个月（95% CI 4.17–4.24）； 风险比0.32（95% CI 0.26–0.41）；P < 0.0001）（图3）。安罗替尼+EC组的PFS显著比EC组的长（5.6 个月（95% CI 5.6–6.8）vs 4.2个月（95% CI 4.17–4.24）；风险比0.44（95% CI 0.36–0.55）；P < 0.0001）（图3）。3.次要终点表1 盲态独立中心评估根据RECIST1.1评价肿瘤反应IRC评估的有客观应答的病人在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼+EC组占比是81.3%（95% CI 75.9–86.0；P=0.0001），安罗替尼+EC组中占比81.2%（95% CI 75.8–85.9；P=0.0003），两者都显著比EC组中占比高（66.8%; 95% CI 60.6–72.6）。有3个病人在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼 +EC组（1.2%），1个在安罗替尼+EC组（0.4%）得到完全应答（表1）。4. 安全性表2a 安全性总结表2b 治疗期间出现的不良反应表2c 治疗相关不良反应任何级别的治疗期间出现的不良事件100%发生在每个组中，在贝莫苏拜单抗 + 安罗替尼 +EC，安罗替尼 +EC，EC组中级别大于等于3的治疗期间出现的不良事件分别占94.3%，95.9%和89.0%（表2a），最常见的毒性包括血小板减少症，中性粒细胞减少症和白细胞减少症（表2b）。治疗相关不良反应在三组中的占比分别为100%，99.6%和99.6%，级别大于等于3的分别是93.1%, 94.3%和87.0%（表2c）。治疗相关不良反应导致死亡在三组中的比例分别为4.5%, 2.5%和1.6%（表2a）。严重不良事件在三组中的占比分别为54.9%, 48.8%和41.1%，级别大于等于3的分别是46.7%, 43.4%和34.1%（表2a）。免疫相关不良事件在三组中的占比分别为42.7%，27.5%，19.1，级别大于等于3的分别是16.7%, 8.2%和6.9%（表2a）。5. 健康相关生活质量（HRQoL） 图4 患者报告的与健康相关的生活质量的结果在所有意向治疗人群治疗组中，EuroQol visual analog scale （EQ-VAS）分数从基线到第34周的平均变化总体上升（表示改善）。每次访问研究组之间的EQ-VAS分数没有显著改变（图4）。•✦研究讨论✦•这个三期试验表明安罗替尼、贝莫苏拜单抗和化疗的结合可能在ES-SCLC一线治疗中对病人OS和PFS有利。严重不良事件在两个治疗组发生相对频繁，支持性护理或者剂量调整用来解决这些事件。剂量调整是一个最大化治疗效果减少毒性的常用策略。这个研究的局限性是没有免疫化疗对照。总结研究意义ETER701试验满足了预先计划的中期分析的主要终点，确认了用安罗替尼、贝莫苏拜单抗和化疗结合作为一线治疗和化疗相比能够显著提高ES-SCLC病人的OS，PFS和应答率。和化疗相比，安罗替尼和化疗结合能够提高PFS和应答率，但是OS没有显著差异。参考文献[1] Cheng, Y., Chen, J., Zhang, W., Xie, C., Hu, Q., Zhou, N., Huang, C., Wei, S., Sun, H., Li, X., et al. (2024). Benmelstobart, anlotinib and chemotherapy in extensive-stage small-cell lung cancer: a randomized phase 3 trial. Nat Med. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41591-024-03132-1 END文案 | 林夕排版 | 林夕审核 | 林夕发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background生物样本库和医疗中心存有大量存档肿瘤组织，这些组织对理解疾病和开发疗法非常重要。为保存细胞形态和防止蛋白质降解，存档组织通常进行化学固定，细胞固定是临床病理学和生物医学研究的关键部分。然而，现有分析技术如免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术和质谱等存在各种不足，例如免疫组织化学和免疫细胞化学只能报告蛋白质目标的存在、定位和分布；流式细胞术需要大量细胞且检测特异性有限；质谱在单细胞检测方面存在困难且不适用于所有蛋白质相关问题；平板凝胶免疫印迹虽然是一种靶向蛋白质组学方法，但传统的开放微流控芯片设计不适用于固定细胞的制备。微流控技术在固定细胞的样本制备中具有优势，基于液滴和反应室的微流控系统可为细胞孵育、裂解和抗原提取提供封闭环境，有助于分析不同类型的细胞和多种固定条件。在分析生物样本库中存档的样本时，需要在提高检测灵敏度和特异性的同时，减少对稀缺样本的消耗，这正是该研究的需求所在。研究目的Objectives引入一种用于化学固定单细胞蛋白质组分析的混合微流控平台DropBlot，以解决现有单细胞分辨率蛋白质组分析工具在特异性和灵敏度方面的不足，同时节约珍贵的存档生物样本。提供适合蛋白质亚型和蛋白质复合物分析的靶特异性，以解决许多这类蛋白质靶点缺乏特定抗体探针的问题。利用DropBlot分析患者来源的肿瘤细胞样本，深入了解肿瘤细胞中蛋白质表达的异质性，为癌症研究和治疗提供新的见解和方法。METHODS•✦研究要点✦•研究过程Sampling一.工作原理概述及步骤 DropBlot是一种用于化学固定单细胞蛋白质组分析的混合微流控平台，通过微流体H - 型连接点产生水包油（W/O）液滴，将单个固定细胞与含有表面活性剂的抗原提取缓冲液共封装在液滴中。DropBlot通过液滴技术实现了对单个固定细胞的抗原提取，然后通过开放流体芯片进行单细胞PAGE和免疫印迹，从而实现了对化学固定单细胞蛋白质组的分析。图1 DropBlot的设计、操作和鉴定二.设计液滴及优化 在选择W/O化学物质和液滴生成条件时，需要考虑多种因素，以确保液滴能够在苛刻的抗原提取条件下保持稳定，同时实现足够的抗原溶解和最小化的抗原泄漏。优化后确定了稳定的的液滴配方后是将固定细胞在液滴中于98°C下孵育60 - 120分钟，以实现抗原提取。在监测期间荧光强度没有显著下降，背景强度几乎保持恒定，并且单个液滴的强度分布在实验前后没有显著差异，这表明该液滴配方能够有效地保存目标蛋白质。图2 设计和产生固定细胞裂解和抗原提取所需的稳定液滴，将液滴装入各个微孔以电转移到裂解的PAGE。图3 蛋白质靶向电转移从微孔封装的W/0液滴到邻接的PAGE凝胶的模拟和验证将含有细胞裂解物的液滴沉降到开放流体芯片的微阱阵列中，然后通过电转移将溶解的蛋白质目标从每个微阱封装的液滴注入到邻近的聚丙烯酰胺凝胶中，进行蛋白质分离。在电转移过程中，通过数值模拟和实验验证了蛋白质从液滴到凝胶的注射效率和分散情况。在合适的条件下，蛋白质能够从液滴中成功电转移到凝胶中，并在PAGE过程中实现有效的迁移和分离。完成PAGE后，通过光捕获将蛋白质固定在凝胶中，然后进行免疫印迹和荧光成像检测。使用特定的抗体探针与蛋白质目标结合，通过荧光信号检测蛋白质的表达情况。通过对不同细胞系和蛋白质目标的分析，验证了DropBlot在单细胞蛋白质组分析中的有效性和特异性。图4 使用纯化蛋白标准品进行DropBlot分析三.检测未固定癌细胞样本测试DropBlot的样本制备和整合功能，评估抗原 - 检索缓冲液（包括SDS）与检索抗原的免疫反应性之间的关系。DropBlot系统适用于分析未固定单细胞的蛋白质目标，能够区分不同细胞系中基于独特指纹蛋白质和蛋白亚型的差异。图5 利用两个未固定的乳腺癌细胞系 MCF7和MDA-MB-231的单细胞进行 DropBlot分析四.测试固定的癌细胞样本 1.PFA固定的癌细胞通过DropBlot技术，从PFA固定的癌细胞系（MCF7和MDA - MB - 231）中成功检测到蛋白质目标。与新鲜癌细胞系相比，从PFA固定细胞中提取的蛋白质目标在PAGE中的电泳迁移速度约慢50%，这是因为PFA固定形成的新共价分子键使蛋白质的斯托克斯半径增大，电泳迁移率降低。增加PFA固定时间（从15分钟增加到30分钟）和抗原检索孵育时间（增加到120分钟）会显著减少可检测到的蛋白质峰的数量和强度。2. 甲醇固定的癌细胞：EpCAM检测：使用DropBlot对甲醇固定的MCF7细胞进分析，虽然EpCAM可被检测到，但电泳迁移速度比PFA固定的细胞更慢。蛋白质聚集：观察到蛋白质信号在微阱附近升高，存在大蛋白质二聚体分子或蛋白质聚集。蛋白亚型分析：通过比较MCF7和MDA - MB - 231细胞中EpCAM和VIM的蛋白亚型分布。电转移效率：PFA固定细胞中蛋白质目标的电转移效率范围为73.2%至84.8%，甲醇固定细胞中为44.4%至49.3%。综上所述，DropBlot适用于分析PFA和甲醇固定细胞中的蛋白质目标，但对于甲醇固定细胞中不溶性蛋白质目标的减少，可能需要进一步优化。图6 使用单个PFA和甲醇固定的癌细胞进行DropBlot分析FINDINGS•✦研究亮点✦•DropBlot的技术优势包括以下几点：1. 适用于固定细胞分析：能够对化学固定的单细胞进行蛋白质组分析，解决了传统开放微流控芯片设计不适用于固定细胞制备的问题。2. 特异性适合蛋白质亚型和复合物分析：提供了适合蛋白质亚型和蛋白质复合物的靶特异性，且许多这类蛋白质靶点缺乏特定的抗体探针。3. 节约珍贵的存档生物样本：采用微流控设计，相比于平板凝胶测定形式，能够减少对稀缺的存档固定生物样本的消耗。4. 能够分析蛋白质亚型：可以分辨不同细胞类型基于其独特指纹蛋白质和蛋白质亚型的差异，例如在分析乳腺癌细胞系时，能够区分上皮细胞系和间充质细胞系中蛋白质的表达差异。5. 检测细胞亚群：通过“细胞门控”模式，能够分析特定细胞亚群中蛋白质亚型的表达情况，如同流式细胞术一样，但在分析蛋白质亚型方面具有独特优势，是流式细胞术或其他现有单细胞免疫测定无法实现的。6. 潜在的扩展性：可整合已建立的样本制备技术以检测稀有细胞，扩大目标检测多路复用，以及改进从FFPE细胞样本中进行抗原检索等。DISCUSSION•✦研究结论✦•DropBlot 可以为珍贵生物样本库的单细胞分辨率蛋白质生物标志物挖掘提供精确的集成工作流程。DropBlot能够从PFA和甲醇固定的细胞中分析蛋白质，具有检测生物样本中有限细胞和蛋白质亚型的潜力，但仍需要进一步优化和改进。参考文献[1] Liu Y, Herr AE. DropBlot: single-cell western blotting of chemically fixed cancer cells. bioRxiv [Preprint]. 2023 Sep 6:2023.09.04.556277. doi: 10.1101/2023.09.04.556277. PMID: 37732260; PMCID: PMC10508777.END文案 | 赵梦溪排版 | 赵梦溪审核 | 赵梦溪发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background尽管靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）或其配体程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点抑制剂在多种癌症中展现出了显著的疗效，但对乳腺癌（BCs）和胰腺癌（PCs）等免疫静止性肿瘤疗效有限。巨噬细胞作为肿瘤微环境（TME）中的关键免疫细胞，不仅通过吞噬作用直接清除癌细胞，还通过抗原递呈和炎性细胞因子的产生，在连接先天免疫和适应性免疫中发挥着至关重要的作用。然而，癌细胞能够通过上调“别吃我”信号，如CD47和CD24，来抑制巨噬细胞的吞噬功能。因此，开发针对这些抗吞噬信号的抑制剂，以恢复巨噬细胞的吞噬活性，成为了增强抗肿瘤免疫反应的新策略。 然而，当前针对单一膜蛋白靶点的抑制剂设计存在诸多局限性，如特异性不足、药效有限以及可能产生的副作用等。为了解决这些问题，广东省心血管疾病生物医学工程技术研究中心蔡延滨等人创新性地提出了超分子组合原位组装CD47和CD24双靶点抑制剂（PAC-SABIs）的概念。该抑制剂通过仿生配体定向表面扩增和酶催化自组装技术，能够在癌细胞膜上实现原位自组装，并呈现生物活性图案，从而同时阻断CD47和CD24两种抗吞噬信号，显著提高巨噬细胞的吞噬能力。此外，这种设计还充分利用了超分子肽工程的优势，实现了多靶点、可编程性和空间控制的完美结合，为下一代免疫疗法的开发提供了全新的思路和方法。（图1）图1.PAC-SABIs的设计和提出的机制。RESULTS•✦研究结果✦•1.PAC-SABIs在肿瘤细胞膜上的原位自组装首先通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像直接监测到 PAC-SABIs 在癌细胞膜上实现原位自组装的过程，并通过扫描电镜观察到PAC-SABIs首先附着在细胞的粘附边缘，然后沿着细胞表面迁移，最终形成覆盖细胞膜的3D网络支架。体外实验表明，PAC-SABIs 能显著抑制 4T1 和 PAN02 细胞的侵袭和集落形成（图2）图2.PAC-SABIs在BC和PC细胞膜上的原位自组装。2.PAC-SABIs治疗促进癌细胞的吞噬清除PAC-SABIs能显著增强巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，其作用超越了直接抗 CD24 mAb 或 超分子组装的CD47单靶点抑制剂（SAMIs）的阻断作用。且巨噬细胞吞噬活性的增强主要是由于 PAC-SABIs 对CD47 和 CD24 的抑制作用，而不是巨噬从 M2 型向 M1 型表型的转变。（图3）图3.通过PAC-SABIs治疗促进癌细胞的吞噬清除。3.体内抗肿瘤疗效和免疫反应PAC-SABIs 在小鼠体内具有良好的生物安全性。体内结果表明，PAC-SABIs不仅激活了给予巨噬细胞的固有免疫反应，还增强了适应性抗肿瘤免疫反应。PAC-SABIs 在 BC 和 PC 模型中都能显著降低肿瘤生长。在 BC 异种移植模型中，PAC-SABIs 的抑瘤效果明显强于双抗体联合疗法。PAC-SABIs具有对抗肿瘤免疫微环境（TIME）中的抗炎特性的能力。此外，在免疫、炎症过程、巨噬细胞吞噬能力和抗原递呈中起核心调节作用的基因在接受 PAC-SABIs 治疗后出现了明显上调。（图4）图4.PAC-SABIs的体内抗肿瘤作用。HIGHLIGHTS•✦研究亮点✦•1成功开发了针对CD47和CD24的双靶点抑制剂PAC-SABIs，该抑制剂通过增强巨噬细胞的吞噬能力和全面激活抗肿瘤免疫反应，展示了其作为新型肿瘤治疗策略的巨大潜力。2PAC-SABIs结合了主动靶向与酶指导的自组装，实现了对生物活性的精准时空控制。其独特的纳米结构能迅速形成动态的仿地衣细胞膜涂层，有效促进巨噬细胞对癌细胞的吞噬清除，提高了治疗效率和特异性。3PAC-SABIs在动物实验中表现出低剂量高效、长期稳定性和低毒副作用的特点，为其临床应用奠定了坚实基础。此外，其模块化设计允许未来加入更多功能模块，为个性化定制治疗提供了可能。参考文献[1] Zhang, W., Zeng, Y., Xiao, Q. et al. An in-situ peptide-antibody self-assembly to block CD47 and CD24 signaling enhances macrophage-mediated phagocytosis and anti-tumor immune responses. Nat Commun 15, 5670 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49825-6END文案 | 张婷婷排版 | 张婷婷审核 | 姜笑南发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其早期诊断和治疗至关重要。肝癌的发病机制复杂，涉及多种因素，包括病毒感染、酒精、脂肪肝等。肝癌的早期症状不明显，往往在晚期才被发现，此时治疗难度大，预后差。荧光手术导航作为一种新兴技术，能够帮助医生更精确地切除肿瘤，并最大程度地保留健康组织，减少术后并发症。肿瘤细胞代谢旺盛，产生大量酸性物质，导致溶酶体酸化。因此，肿瘤细胞内溶酶体pH值显著低于正常细胞。pH值可以作为肝癌微环境的酸碱度标志，用于区分肿瘤细胞和正常细胞。组织蛋白酶是一类重要的溶酶体蛋白酶，在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用。组织蛋白酶能够降解细胞外基质，促进肿瘤细胞浸润和转移。此外，组织蛋白酶还能够激活其他蛋白酶，进一步促进肿瘤的进展。荧光探针是荧光手术导航的关键，直接影响手术的结果。传统的单锁荧光探针（例如仅响应pH值或组织蛋白酶）在复杂的生物环境中容易受到干扰，导致信号/背景比（SBR）低，影响成像的准确性。为了克服这一局限性，本研究设计了双锁荧光探针SiR-CTS-pH，使其同时响应pH值和组织蛋白酶。传统探针设计主要依赖于化学家和生物学家的经验，难以保证设计的准确性，且研发周期长，需要进行大量的实验，需要消耗大量的试剂和材料，成本高。机器学习算法能够从大量的数据中学习规律，并预测未知分子的性质，从而指导分子设计和合成。因此，本研究利用机器学习辅助设计了一例新型双锁荧光探针SiR-CTS-pH，以提高荧光导航手术切除肝癌的准确性和SBR。（图1）图1 荧光探针的设计理念和应用CONTENTS•✦研究方法✦•1机器学习辅助设计数据收集：从文献中收集了113种具有实验pKcycl值的氧杂蒽染料数据，并使用简化分子输入线性系统（SMILES）进行结构表示。特征提取：使用扩展连接指纹（ECFP）进行结构表征，并进行了特征降维，最终保留了49个重要的特征。模型训练：使用六种不同的机器学习算法（KRR、rbf-kernel-based SVR、RF、XGB、LGB、ANN）进行模型训练，并通过十折交叉验证进行模型评估。模型选择：根据模型性能指标（R2、RMSE、MAE），选择了XGB模型作为最终的预测模型。模型解释：使用SHAP分析对模型进行解释，揭示了分子结构特征对pKcycl值的影响，并指导了新型荧光探针分子的设计。2理论计算使用DFT计算SiR-CTS-pH和SiR-pH的分子构象和电子结构，解释其光谱特性。使用分子对接技术模拟SiR-CTS-pH与组织蛋白酶的结合模式，解释其响应组织蛋白酶的机制。3体外实验pH响应实验：在Britton-Robinson (B-R) 缓冲溶液中，测试SiR-pH和SiR-IapH的pH响应能力。组织蛋白酶响应实验：在含有组织蛋白酶的缓冲溶液中测试SiR-CTS-pH的响应特性。细胞成像实验：在肝癌细胞（HepG2）和正常细胞（HL-7702）中测试SiR-pH、SiR-CTS和SiR-CTS-pH的细胞成像效果，并建立肝癌细胞和正常细胞的混养模型以及三维立体细胞球模型模拟体内肿瘤细胞的生长环境。细胞毒性实验：使用CCK-8法测试SiR-CTS-pH和SiR-pH的细胞毒性。细胞共定位实验：使用Lysosome Tracker Green评估SiR-CTS-pH在溶酶体中的定位能力。光稳定性实验：使用激光扫描显微镜测试Si-Rhodamine-pH和Lysosome Tracker Green的光稳定性。4体内实验皮下肿瘤小鼠模型：建立皮下肿瘤小鼠模型，并在肿瘤部位注射SiR-pH、SiR-CTS和SiR-CTS-pH，观察其荧光成像效果。肝癌小鼠模型：建立肝癌小鼠模型，并分别进行尾静脉注射和原位喷洒SiR-CTS-pH，观察其荧光成像效果。组织切片实验：对肝癌小鼠的肝脏进行组织切片，并使用免疫荧光染色和苏木精-伊红 (H&E) 染色，验证SiR-CTS-pH的成像效果。图2 机器辅助探针设计RESULTS•✦研究结果✦•基本信息描述1. 机器学习模型准确有效模型能够准确预测氧杂蒽染料的pKcycl值，并成功指导设计了新型荧光探针分子。染料SiR-pH的预测pKcycl值为3.95，而染料SiR-IapH的预测pKcycl值为4.10。此两种染料的预测pKcycl值均低于4.5，适合溶酶体酸激活探针的设计。（图2）2. 光谱实验结果染料SiR-pH的实验pKcycl值为3.95，而染料SiR-IapH的实验pKcycl值为4.10。因此，选择SiR-pH作为探针的母体，并引入组织蛋白酶特异性基团Val-Cit，构建双锁探针SiR-CTS-pH。探针的光谱响应实验结果表明，SiR-CTS-pH能够序列响应组织蛋白酶和pH，实现荧光信号的开启，具有高选择性、响应迅速，灵敏度高等优点，为肝癌的精准治疗提供了新的思路和工具。（图3）3. 细胞实验结果无论是在单独培养的肿瘤细胞和正常细胞模型，还是肿瘤细胞和正常细胞的混养模型，亦或是三维立体细胞球模型中，与单因素激活的对比探针相比，SiR-CTS-pH具有更高的SBR和更强的肿瘤细胞识别能力，能够准确区分肝癌细胞和正常细胞（图4和图5）。使用Lysosome Tracker Green验证SiR-CTS-pH在HepG2细胞中的溶酶体定位，共定位效果良好。商业染料Lysosome Tracker Green在连续照射10分钟后，荧光强度降低约50%。与商业染料相比，Si-Rhodamine-pH在连续照射10分钟后，荧光强度降低约30%。以上结果表明探针具有良好的光稳定性，适合成像。4. 体内成像结果在皮下肿瘤小鼠模型中，SiR-CTS-pH的荧光成像效果明显优于SiR-pH和SiR-CTS，肿瘤与正常组织的荧光强度比值高达7.4，而对比探针SiR-CTS（不具备pH激活能力）的比值为2.3，SiR-pH的比值为2.0。（图6）在肝癌小鼠模型中，尾静脉注射SiR-CTS-pH后，肿瘤部位的荧光成像效果明显，能够区分肿瘤和正常组织。（图6）原位喷洒SiR-CTS-pH后，肝上的肿瘤处的荧光信号明显，能够精准地照亮整个肿瘤轮廓，而正常肝组织无荧光。（图7）使用免疫荧光染色和H&E染色验证SiR-CTS-pH的成像效果，探针区分出来的肝癌细胞与正常细胞的边界与上述两种方法得到的结果基本一致，表明SiR-CTS-pH能够准确识别肝癌组织。（图7）图3 探针对组织蛋白酶和pH的光谱响应结果            图4 探针对肿瘤细胞的特异性成像能力评估  图5 探针在三维立体细胞球模型中区分肝癌细胞的能力  图6 探针在皮下肝癌模型和原位肝癌模型中的成像能力评估  图7 探针在荧光手术导航中的应用DISCUSSION•✦研究讨论✦•总结Summary本文展示了机器学习在指导新型荧光探针设计方面的巨大潜力，并成功开发了一种具有高信噪比和优异肿瘤识别能力的双锁荧光探针 SiR─CTS-pH，为特异性肿瘤成像和荧光手术导航提供了新的工具和方法。未来需要进一步研究 SiR─CTS-pH 在临床应用的可能性，克服临床应用中的困难，最终实现临床转化，造福肝癌患者。参考文献[1] Fei-Fan Xiang, Hong Zhang, Yan-Ling Wu, Yu-Jin Chen, Yan ZhaoLiu, Shan-Yong Chen, Yan-Zhi Guo,Xiao-Qi Yu,and KunLi， Machine-Learning-Assisted Rational Design of Si─Rhodamine as Cathepsin-pH-Activated Probe for Accurate Fluorescence Navigation，Adv. Mater. 2024, 2404828END文案 | 陆细刚排版 | 陆细刚审核 | 陆细刚发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展