INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background慢性乙型肝炎（CHB）是全球最常见的病毒性肝炎之一，约有2.6亿人受到其影响，每年导致超过70万人因肝硬化和肝细胞癌而导致死亡。尽管抗病毒治疗，如核苷类似物和干扰素的联合使用，广泛应用于CHB患者，但这些治疗方法无法根除病毒，实现CHB的功能性治愈仍然是一个巨大的挑战。除此之外，肝内炎症的形成机制尚不完全清楚，而多组学研究为揭示CHB肝内炎症机制提供了新的希望。近日，深圳三院—深圳国家感染性疾病临床医学研究中心卢洪洲/陆蒙吉/王俊/李倩团队在iMeta（IF=23.7，位列微生物学期刊全球TOP 2/161）发表了题为 Cell-type specific expression analysis of liver transcriptomics with clinical parameters to decipher the cause of intrahepatic inflammation in chronic hepatitis B 的研究论文，以解析慢乙肝患者肝内炎症相关基因细胞特异性差异表达探索肝内炎症发生机制。研究目的Objectives该研究旨在通过整合肝脏的整体转录组数据、单细胞测序数据和临床数据，从多组学角度分析导致CHB肝内炎症形成的因素。研究团队开发了一个贝叶斯线性模型，将基因表达与临床参数联系起来，并更新了特定细胞类型的表达分析（PSEA），以在不同临床阶段将整体基因表达分解为特定细胞类型。这种多组学整合的方法可以帮助我们揭示CHB肝内炎症的细胞和分子机制，为未来的诊断和治疗提供新的见解（图1）。图1 该研究的研究流程KEY POINTS•✦研究要点✦•研究过程Process1、患者分组与临床阶段 研究团队选取了82名CHB患者，根据HBeAg状态、HBV血清载量和血清ALT水平，将患者分为四个临床阶段：HBeAg阳性慢性感染、HBeAg阳性慢性肝炎、HBeAg阴性慢性感染和HBeAg阴性慢性肝炎。对肝活检样本进行的组织学检查排除了脂肪肝和其他肝病患者。2、肝内基因表达上调 主成分分析（PCA）显示，CHB患者肝内基因表达谱在慢性肝炎阶段显著上调，特别是与免疫过程相关的基因富集。基因集富集分析（GSEA）揭示了多种已知的肝损伤途径，如细胞凋亡、焦亡、坏死和自噬性细胞死亡的上调。（见图2）PCA分析：揭示慢性肝炎阶段与慢性感染阶段在基因表达上的显著差异。GSEA分析：显示多种与免疫和炎症相关的基因在慢性肝炎阶段上调，如细胞因子、趋化因子和干扰素刺激基因（ISGs）。图2 肝内基因表达上调（该图展示了基于单细胞 RNA 测序数据的肝脏中细胞类型特异性标记基因，揭示了与免疫过程相关的基因富集。图中还包括了与肝损伤相关的途径，如细胞凋亡、焦亡、坏死和自噬性细胞死亡的上调情况。）3、单细胞RNA测序与细胞类型特异性标记基因 研究合并并标准化了来自人类肝脏的三组10×基因组单细胞RNA测序数据，映射并可视化了13种细胞类型。通过UMAP方法，将这些细胞类型如肝细胞、胆管细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞等进行展示和分析。（见图3） 通过UMAP方法分析了单细胞RNA测序数据，识别并可视化了肝脏中的13种细胞类型，包括肝细胞、胆管细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞。每种细胞类型都有特异性的标记基因，如肝细胞的ALB、胆管细胞的KRT19、T细胞的CD3D、B细胞的CD79A和巨噬细胞的CD68。图3 单细胞RNA测序与细胞类型特异性标记基因（该图展示了三组10×基因组单细胞RNA测序数据的UMAP分析结果，识别出13种肝脏细胞类型。每种细胞类型都通过特异性标记基因进行标识，如肝细胞的ALB、胆管细胞的KRT19、T细胞的CD3D、B细胞的CD79A和巨噬细胞的CD68。）4、免疫细胞特征与肝损伤的相关性 T细胞、NK细胞、成熟B细胞和巨噬细胞在肝炎阶段的肝样本中表达显著上调。血清ALT水平与大多数T细胞和巨噬细胞标记基因呈正相关，而肝细胞标记基因则呈负相关。（见图4） 研究发现，T细胞、NK细胞、成熟B细胞和巨噬细胞在肝炎阶段的表达显著上调，血清ALT水平与这些细胞的标记基因呈正相关，表明它们在肝损伤中起重要作用。相反，肝细胞标记基因与ALT水平呈负相关。图4 免疫细胞特征与肝损伤的相关性（该图展示了在肝炎阶段，T细胞、NK细胞、成熟B细胞和巨噬细胞的标记基因表达显著上调，血清ALT水平与这些细胞标记基因呈正相关，而肝细胞标记基因则呈负相关，表明这些免疫细胞在肝损伤中的重要作用。）5、趋化因子与免疫耗竭标记基因 研究通过PSEA模型分析，发现趋化因子如CCL20和CXCL8主要由巨噬细胞和T细胞表达，这些基因与ALT水平呈显著正相关，表明其在肝损伤中的重要作用。（见图5、6）此外，免疫耗竭标记基因如PDCD1（编码PD-1）和HAVCR2（编码TIM-3）在肝炎阶段上调，提示免疫细胞在慢性肝炎中的功能耗竭。图5 趋化因子与免疫耗竭标记基因（该图展示了通过PSEA模型分析的结果，趋化因子如CCL20和CXCL8主要由巨噬细胞和T细胞表达，这些基因与ALT水平呈显著正相关。此外，免疫耗竭标记基因如PDCD1（编码PD-1）和HAVCR2（编码TIM-3）在肝炎阶段上调，提示免疫细胞在慢性肝炎中的功能耗竭。）图6 T 细胞耗竭标志物和巨噬细胞活化趋化因子的病理学验证6、干扰素刺激基因（ISGs）的作用 研究分析显示，79个ISGs在肝炎阶段上调，其中包括STAT1、STAT2、ISG15、ISG20等。通过PSEA模型，发现T细胞和巨噬细胞主要贡献了这些基因的表达，而B细胞和肝细胞的ISGs表达则与ALT水平无显著相关。（见图7、8）研究发现，79个ISGs在肝炎阶段显著上调，包括STAT1、STAT2、ISG15和ISG20。这些基因主要由T细胞和巨噬细胞表达，表明干扰素信号在肝炎中的重要作用。相较之下，B细胞和肝细胞的ISGs表达与ALT水平无显著相关。图7 干扰素刺激基因（ISGs）的作用（该图展示了79个干扰素刺激基因（ISGs）在肝炎阶段显著上调的情况，包括STAT1、STAT2、ISG15和ISG20。通过PSEA模型分析，T细胞和巨噬细胞主要贡献了这些基因的表达，显示出干扰素信号在肝炎中的重要作用。）图8 CHB 肝脏中不同细胞类型特异性干扰素刺激基因的病理学验证FINDINGS•✦研究亮点✦•1、多组学整合分析：通过整合肝脏的整体转录组数据、单细胞测序数据和临床数据，从多组学角度全面分析CHB肝内炎症形成的机制。2、细胞类型特异性表达分析：通过PSEA模型，将整体基因表达分解为特定细胞类型，揭示了不同细胞类型在肝损伤中的特定作用。3、趋化因子与ISGs的关键作用：发现趋化因子如CCL20和CXCL8在肝损伤中的重要作用，以及特定ISGs在肝炎阶段的上调，揭示了其在肝损伤中的潜在机制。这些基因的显著上调和表达模式的变化提供了关于CHB肝内炎症形成的新见解，可能成为未来治疗的潜在靶点。DISCUSSION•✦研究结论✦•本研究通过多组学整合分析，揭示了慢性乙型肝炎肝内炎症形成的关键因素。研究表明，特定细胞类型在肝损伤中的作用，以及趋化因子和干扰素刺激基因在肝炎中的上调，提供了关于肝炎机制的深刻见解。通过了解这些基因和细胞类型在CHB中的具体作用，未来可以开发更有效的诊断工具和治疗策略，以改善CHB患者的预后。参考文献[1] Jun Wang, Qian Li, Yuanwang Qiu, Simo Kitanovsk et al. Cell-type-specific expression analysis of liver transcriptomics with clinical parameters to decipher the cause of intrahepatic inflammation in chronic hepatitis B. 2024. Published 2024 July 4.END文案 | 谢晓婷排版 | 谢晓婷审核 | 谢晓婷发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background在当今社会，人们越来越关注健康问题，尤其是肥胖症。据世界卫生组织统计，全球约有6.5亿成年人患有肥胖症，而我国肥胖人口已超过9000万，居全球首位。肥胖不仅影响美观，更严重的是，它与多种慢性疾病密切相关，如心血管疾病、糖尿病、高血压等。因此，寻找有效控制体重的方法已成为全球科研人员关注的焦点。近年来，科学家们发现，大脑中的神经递质——多巴胺在调节食欲和体重方面发挥着重要作用。本文将探讨一种新的神经通路——尾端腹侧被盖区（cVTA）至外侧下丘脑核（LPBN）的多巴胺神经环路，其在控制摄食行为和体重调节中的关键作用。这一发现有望为肥胖症的治疗提供新的思路和方法。研究意义Significance本研究揭示了尾端脑多巴胺神经回路通过增强饱腹感来预防体重增加的机制，为理解摄食行为和体重控制提供了新的视角，为开发针对肥胖和食欲控制的精准治疗方法提供了理论基础。HIGHTSPOT•✦研究亮点✦•1DAVTA神经元通过增强饱腹感反应来抑制摄食行为，从而有效减少总食物摄入量和体重。2揭示了DAVTA神经元在每次摄食行为结束前立即激活，通过增强饱腹感反应来促进摄食行为的终止。345证实了DRD1LPBN神经元在调节饱腹感反应和摄食行为终止中发挥关键作用。多巴胺类药通过增强DAVTA→LPBN→DRD1神经环路来抑制摄食和减轻体重。提供了潜在的神经环路靶点，为开发针对肥胖和饮食相关疾病的治疗策略提供了新思路。FINDINGS•✦研究发现✦•1、神经元通过抑制食欲控制体重（图1）本文研究了位于尾端中脑的DA神经元如何通过与后脑的DRD1LPBN神经元相互作用来控制摄食行为，从而防止体重增加。研究发现，DA神经元在摄食行为结束前会增强活动，通过抑制DRD1LPBN神经元来增强饱腹感，减少摄食量。此外，多巴胺再摄取抑制剂如哌醋甲酯（MPH）可以通过增强这一神经回路来抑制食欲，减轻体重。揭示了DA神经元在控制摄食行为和体重方面的关键作用，为开发治疗肥胖和饮食相关疾病的策略提供了新的视角。图12、神经环路可抑制摄食行为（图2）我们都知道，在进食过程中，大脑起着至关重要的调控作用。图2就展示了大脑中负责调节进食欲望的一个关键区域 - 外侧枕皮质(LPBN)。LPBN区域中含有一群特殊的神经元，它们表达着DRD1受体。这些DRD1神经元接受来自大脑后部多巴胺神经元的直接投射，形成了一条重要的神经通路。当我们进食时，这些多巴胺神经元会被激活，大量释放多巴胺。多巴胺随后作用于LPBN区域的DRD1神经元，激活DRD1受体从而增强饱腹感，抑制进一步的进食欲望。相反，如果抑制或破坏LPBN区域的DRD1神经元，就会降低饱腹感，导致进食持续时间延长，最终引发体重增加。这就把LPBN区域的DRD1神经元比作大脑中的"饥饿开关"。图23、多巴胺D1受体调节饱腹感和摄食行为（图3）大脑中存在一条重要的神经回路，在调节饱腹感和体重控制中扮演着关键角色。这条神经回路起源于大脑后部的一群多巴胺神经元，它们直接投射到脑桥核的DRD1神经元上。激活这些DRD1神经元可以抑制进食行为，从而有效防控体重增加。而如果敲除LPBN区域的DRD1基因，则会导致进食增加和体重增加。这就说明，DRD1-LPBN这个神经通路在调节食欲和体重调节中非常关键。更有意思的是，常见的减肥药甲基苯丙胺，正是通过激活这个DRD1-LPBN神经回路，从而发挥其抑制进食、降低体重的作用。这就是甲基苯丙胺减肥的"秘密武器"所在。图34、激活神经环路发挥减食作用（图4）研究发现，常见的减肥药甲基苯丙胺，之所以能够抑制进食、降低体重，其关键机制就在于激活大脑中的一条特殊神经回路。具体来说，甲基苯丙胺可以兴奋位于大脑后部的一群多巴胺神经元，使它们大量释放多巴胺。这些多巴胺神经元会直接投射到脑桥核的DRD1神经元上，激活DRD1受体从而抑制进食行为。进一步的研究发现，如果将LPBN区域的DRD1基因敲除，那么即便服用甲基苯丙胺，其抑制进食和降低体重的效果也会大大减弱。这就说明，DRD1-LPBN这个神经通路在甲基苯丙胺降低体重中扮演着关键角色。图45、利用多巴胺D1受体信号通路控制食欲（图5）在进食过程中，位于大脑后部的多巴胺神经元(DAcVTA neurons)会在进食结束前被激活，释放大量多巴胺。这些多巴胺作用于脑桥核的DRD1神经元，激活DRD1受体从而增强饱腹感，抑制进一步的进食行为。反过来，如果抑制这些多巴胺神经元的活性，就会降低饱腹感，延长进食时间，最终导致体重增加。而直接激活DRD1神经元，同样能够抑制进食，从而有效预防体重增加。总之，激活这条"瘦身神经回路"无疑是预防肥胖的关键。未来如果我们能够找到安全有效的方法，精准调控这个神经回路，相信必将为治疗肥胖带来新的希望。图5DISCUSSION•✦研究讨论✦•小结这篇文章探讨了大脑中一条重要的神经回路，它在调节饱腹感和体重控制中扮演关键角色。这条神经回路起源于大脑后部的多巴胺神经元，它们直接投射到脑桥核DRD1神经元。当我们进食时，多巴胺神经元被激活，释放多巴胺。多巴胺作用于DRD1神经元，激活DRD1受体以增强饱腹感，抑制进一步进食。反之，抑制多巴胺神经元或破坏DRD1神经元，则会降低饱腹感，导致过度进食和体重增加。而直接激活DRD1神经元，也能有效防控体重增加。总之，这条多巴胺-DRD1神经回路在体重调节中扮演关键角色。深入了解和精准操控这个"瘦身神经回路"，有望为预防和治疗肥胖带来新突破。研究局限性1研究对象局限于动物模型：文中大部分研究结果都来自于小鼠和大鼠等动物实验，还需要进一步验证这些结果在人类身上是否适用。2研究手段侧重于操控性实验：文中通过人工激活或抑制相关神经元，观察体重变化等指标。但临床上如何精准调控这些神经回路仍需进一步探索。34缺乏长期随访数据：文中未提及这些神经回路的长期调控效果，是否能够持续维持体重平衡还有待进一步观察。未涉及其他影响因素：除了神经回路调节，个体的饮食习惯、身体活动、遗传因素等都会影响体重，文中没有涉及这些其他因素。参考文献[1] Yong Han et al.,A hindbrain dopaminergic neural circuit prevents weight gain by reinforcing food satiation.Sci. Adv.7,eabf8719(2021).PROFILE吴琦博士，贝勒医学院暨美国农业部儿童营养研究中心研究员，曾获得皮尤PEW生物医学学者和Kavli基金会学者等荣誉称号。吴博士团队广泛利用基因改造小鼠模型，包括病毒介导的基因和细胞消融、细胞特异性神经回路映射，并结合药理学、电生理学方法，以及行为和代谢分析，来探究调控进食行为、神经内分泌、能量稳态、神经精神状态和认知行为的基础机制，在正常条件下以及肥胖和神经系统异常中。END文案 | 胡宇博排版 | 胡宇博审核 | 胡宇博发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background 缺氧是指生物体内氧分压低于正常水平的现象，是许多生理和病理过程中重要的微环境因素。在正常生理条件下，缺氧可以参与组织修复、血管生成和细胞分化等过程。然而，在许多病理状态下，如肿瘤、炎症、缺血性疾病和神经退行性疾病等，缺氧往往伴随着细胞损伤和功能障碍，并促进疾病的进展。传统的缺氧检测方法主要包括免疫组化染色、电子顺磁共振波谱分析和生物发光成像等。这些方法通常难以实现对整个器官或身体中缺氧区域的全面观察。近年来，组织透明化技术逐渐兴起，该技术可以去除组织中的散射光，使组织变得透明，从而实现深度无关的荧光成像。然而，传统的荧光探针在组织透明化过程中容易被洗脱，难以与组织透明化技术结合使用。此外，许多荧光探针的荧光性质会受到折射率匹配溶液（RIMS）的影响，导致荧光信号减弱或消失。研究目的Objectives本研究旨在开发一种能与组织透明化技术兼容的新型可激活共价荧光探针，用于缺氧组织的标记，从而实现对活体小鼠全身体和全器官的缺氧三维成像，为探索缺氧相关的生物学现象提供新的工具，并有助于深入了解缺氧在疾病发生发展中的作用机制。CONTENTS•✦研究内容✦•研究亮点1、荧光染料与RIMS的兼容性研究研究者对多种荧光染料在不同RIMS中的光物理性质进行了研究。研究者选择了荧光素异硫氰酸酯（FITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、硅罗丹明、青色素3（Cy3）和青色素5（Cy5）等代表性染料，并测量了它们在BABB和CUBIC-R等代表性RIMS中的荧光亮度、吸收光谱和荧光光谱。2、可激活共价荧光探针的设计和合成为了克服荧光染料与RIMS之间的不兼容性，作者以2-硝基咪唑化合物pimonidazole为基础，合成了10种与不同荧光染料连接的Pimo-Dye探针。Pimo-Dye探针的化学结构如图所示，其中pimonidazole部分负责与缺氧组织中的蛋白质发生共价结合，而荧光染料部分负责产生荧光信号。（图1）3、细胞和活体实验评估Pimo-Dye探针在细胞和活体层次的缺氧检测能力。4、组织透明化和三维成像为了实现活体小鼠的全身体和全器官的缺氧三维成像，研究者将Pimo-Dye探针与组织透明化技术结合使用。首先，研究者将Pimo-Dye探针注入活体小鼠体内，并使其与缺氧组织中的蛋白质发生共价结合。然后，研究者对小鼠进行灌注固定和组织透明化处理，并使用光片荧光显微镜对透明化后的组织进行三维成像。图1 Pimo-Dye探针的化学结构及应用RESULTS•✦研究结果✦•基本信息描述1. Pimo-Dye探针与RIMS的兼容性良好FITC和硅罗丹明在RIMS中的荧光亮度显著降低，而Cy3、Cy5、Me-Si-Rhodamine、PO-Rhodamine和BODIPY等染料的荧光亮度在RIMS中保持稳定或有所提高。Pimo-Si-Rhodamine、Pimo-Me-Si-Rhodol和Pimo-BODIPY在RIMS中的荧光亮度保持稳定或有所提高，能够满足组织透明化成像的需求。2. Pimo-Dye探针具有高效的缺氧检测能力细胞实验结果表明，Pimo-Si-Rhodamine、Pimo-Me-Si-Rhodol和Pimo-BODIPY能够在缺氧条件下特异性地标记细胞，并具有良好的信噪比。活体实验结果表明，Pimo-Si-Rhodamine、Pimo-Me-Si-Rhodol和Pimo-BODIPY能够在缺氧条件下特异性地标记肾脏组织，并能够在组织透明化过程中保持荧光信号。（图2）图2 探针在细胞和组织层次检测缺氧3. Pimo-Dye探针可用于活体小鼠的全身体和全器官的缺氧三维成像通过组织透明化技术和光片荧光显微镜，成功实现了对标记了Pimo-Dye探针的小鼠肾脏和全身体中缺氧区域的单细胞分辨率成像。（图3）4. Pimo-Dye探针揭示了肝脏中的严重缺氧区域研究发现，Pimo-Me-Si-Rhodol标记的荧光信号不仅出现在肾脏，还出现在肝脏。进一步的分析表明，肝脏中央静脉周围的区域存在严重的缺氧现象，这与以往的研究结果一致。图3 探针实现全肾脏和全小鼠成像DISCUSSION•✦研究讨论✦•研究局限性首先，组织透明化过程中可能会产生假缺氧，需要进一步优化实验方案以避免。其次，需要进一步研究Pimo-Dye探针在不同组织中的分布情况，以排除荧光信号的非特异性来源。再者，Pimo-Dye探针的光稳定性需要进一步提高，以满足长时间成像的需求。总结Summary缺氧是许多生理和病理过程中重要的微环境因素，对细胞功能和疾病发生发展具有重要作用。本研究开发的可激活共价荧光探针与组织透明化技术有机结合，为研究缺氧相关的生物学现象提供了新的工具，并有助于深入了解缺氧在疾病发生发展中的作用机制。未来，该技术有望在多种疾病的诊断和治疗研究中发挥重要作用。参考文献[1] Daichi M. Sakamoto, Iori Tamura, Bo Yi, Sho Hasegawa, Yutaro Saito, Naoki Yamada,Yoichi Takakusagi, Shimpei I. Kubota, Minoru Kobayashi, Hiroshi Harada, Kenjiro Hanaoka, Masayasu Taki, Masaomi Nangaku, Kazuki Tainaka, and Shinsuke Sando , Whole-Body and Whole-Organ 3D Imaging of Hypoxia Using an Activatable Covalent Fluorescent Probe Compatible with Tissue Clearing，ACS Nano 2024, 18, 5167-5179.END文案 | 陆细刚排版 | 陆细刚审核 | 陆细刚发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background转座子是能够在基因组不同位置移动的DNA片段。转座子广泛存在，并且已经显著影响了基因组多样性和进化。IS21家族是广泛存在于细菌中的转座子，已经被发现存在于临床上重要的多重抗药性菌株和人类病原体中。由于它们的简单而强的活力，IS21被作为机理研究的模型。IS21的典型序列包含两个反向重复序列（TIR），它还编码两个参与转座的重要蛋白，IstA和IstB。转座酶IstA需要调节因子IstB来进行转座。IstB是AAA+ ATPase家族的一个成员。它由一个N端延伸和ATPase结构域组成。虽然之前的研究已经体现了IstB能够自我聚合成一个二聚体的五聚体，并且IstB对于促进IstA催化的转座至关重要，但IstB是如何通过N端结构域二聚化并且如何特异性结合DNA使它弯曲还不清楚，IstB是如何招募IstA转座酶到DNA上并能够促进转座活动也还不清楚。研究目的Aim1.探究核苷酸是如何调控IstA催化的转座的。2.探究IstB具体如何结合DNA。3.探究IstB如何促进IstA的招募与激活。METHODS•✦研究方法✦•1纯化分别在E. coli C41(DE3) 和 E. coli BL21codon-plus (DE3)中表达的来自G. stearothermophilus的全长的IstA和IstB。2体外整合反应被用来检测IstA/IstB对整合活性的影响。预切割的供体DNA分子为55bp长的双链，含有R-TIR，由一条转移链和一条非转移链构成。转移链末端为一个通常被转座酶攻击的活性3' OH的CA二核苷酸。非转移链包括一个5nt的5' overhang（图1）。体外整合反应是在含有MgCl2和ATP的HEPES缓冲液中进行的。IstA和供体DNA预先孵育，IstB和作为靶DNA的超螺旋质粒预先孵育。两者混合后在37摄氏度孵育15，30或60min，终止反应后样品进行琼脂糖凝胶电泳和显影。图1 体外整合反应示意图3无细胞转座反应被用来检测IstA突变体的转座活性。反应中有含MgCl2，DTT，dNTPs 和 ATP的反应缓冲液，纯化的IstA和 IstB，含IS21 TIR的供体质粒和E. coli BL21(DE3) 细胞提取物。反应在37摄氏度下孵育60min，相对于没有蛋白的对照，插入的频率由qPCR测定，引物对应了供体质粒和转座产物。4ATPase反应被用来检测IstB的活性。ATPase反应是在含MgCl2和 ATP的HEPES缓冲液中进行。IstB单独加入或结合IstA加入。在37摄氏度孵育1h后，ATPase活性用磷酸盐检测试剂盒检测。5链转移复合物（STC） DNA的重建：STC DNA由三条单链DNA构成：130nt的TIR转移链包含了转座子右端TIR、插入序列和靶DNA序列；60nt的非转移链包含转座子右端TIR的互补序列和一个5nt长的5' overhang；靶DNA的互补序列。等摩尔量混合并退火三条单链DNA，然后加入IstA和IstB使其二聚化成为STC DNA。图2 STC的设计和组装示意图6IstB-靶DNA复合物的形成和玻璃化：IstB和靶DNA相互混合，凝胶层析，对应IstB-DNA峰的成分被留下用于cryo-EM实验。7IstA-IstB-STC 全转座体复合物的形成：IstA与STC DNA相互混合，在STC缓冲液中被稀释，37摄氏度孵育45min，再与在STC缓冲液中的IstB E167Q相互混合，在37摄氏度孵育30min。FINDINGS•✦研究发现✦•1. IstB AAA+促进IS21转座之前的研究表明IstB ATPase对于IstA促进DNA转座是必需的，但是核苷酸的结合和水解在IstA的招募、激活和DNA转座中的具体作用还不清楚。作者因此探究IstB催化活性如何调控IstA催化的转座。首先，他们纯化了来自IS21家族成员的IS5376的已知对AAA+活性重要的ATPase突变体（如Walker A (WA), Walker B (WB), arginine finger (RF) 和 sensor II），然后测定了它们的整合活性。和之前的研究一致，结果显示IstB对于链转移是必需的，但IstB ATPase突变体仍然有整合活性（图3c）。接下来他们想要进一步定义核苷酸在转座过程中的作用。他们用野生型IstB重复了转座实验。在ADP或慢慢水解的ATP类似物 ATPγS条件下，整合反应仍然能够进行但是被减弱，尤其是ATPγS（图3d）。总的来说，核苷酸转换对于IstB支持IstA促进转座有着重要功能。图3 IS21构成与IstB的结构和功能的鉴定2.自我抑制的IstB改变双链DNA的构象IstB具体如何结合DNA，活性位点在寡聚状态下如何防止ATP水解还不清楚。为了解决这些问题，cryo-EM被用来观察IstB在ATP存在的情况下结合DNA的结构。得到一个3.2 Å分辨率的结构后，发现cryo-EM图的质量允许AAA+ ATPase区域的晶体结构重建。他们也进行了蛋白N端及其靶DNA的从头构建模拟，产生了一个IstB-ATP-靶DNA复合物模型（图3e）。和之前的低分辨率研究一致，cryo-EM展示IstB使用了它的N端结构域形成二聚物，二聚物能够通过ATP依赖的AAA+结构域互相作用寡聚形成蛤壳型十聚物（图3e,f)。在IstB十聚物中，已知8个核苷酸结合位点采用了典型的AAA+ ATPase构象，典型特征是其中一个单体的带正电的RF和相邻的亚基中的WA、WB典型基序相互作用（图3e,g）。EM图显示ATP在所有结合口袋中密度清晰（图3g）。这里的高分辨率图展现的十聚物中的AAA+结构域和在一种不可水解的类似物存在下分离的ATPase的晶体结构看到的不同（图3h）。IstB单体的旋转和倾斜导致了关键催化氨基酸的错位使IstB能维持自我抑制的构象。IstB的首65个氨基酸是由3个小的α螺旋构成的，它们构成了二聚化分界面并且通过一个延长的螺旋延伸到AAA+结构域。许多带正电的氨基酸和靶DNA相互作用（图3f）。这些氨基酸和AAA+结构域的一个保守区域形成了每个IstB二聚物的内部腔。二聚物主要是通过非特异性作用和磷酸二酯骨架相联系的。IstB二聚物组装成十聚物产生了一个连续的U形的一个通道，它追踪了DNA的周期性（大约10.5bp）并使靶DNA弯曲大约180度（图3i）。3. IS21 转座体重建为了更好的理解IstB是如何促进IstA的招募与激活，他们重建了结合在转移链DNA上的IstA和IstB。IS21催化途径被认为和大多数转座系统相似。IstA转座酶首先配对并切割转座子末端产生两个游离的3’ OH基团（图4a），然后催化亲核攻击产生两个粘性末端，将供体分子整合到靶DNA，这个DNA产物称为STC。在体外，当只和分离的转座子右末端孵育，相比于与左端和右端相同摩尔量混合物孵育，IstA展现出相似的活性和3D结构。因此，为了减少结构的不对称性，作者做出了一个130bp长的DNA供体分子，它的末端包括R1和R2 重复序列（图4b和图2）。对于靶DNA来说，由于IS21没有很强的特异性，他们用了IS21首选的插入序列。因为很多IS21家族成员在转座之后产生5bp重复序列，因此插入位点相隔为5bp（图4b）。然后用凝胶层析和负染色EM优化缓冲液条件、蛋白质浓度和蛋白质/DNA比例来最大化转座体的形成。初步分析用野生型蛋白组装的样品的复合物是不稳定的，他们因此用IstB E167Q突变体来形成一个看起来和用野生型蛋白相同的更稳定的复合物。Cryo-EM结构显示IS21全转座体是由一个IstA四聚体和两个IstB十聚物组成的（图4c）。图4 IstA-IstB STC结构4. IstB捕获S型靶DNA两个IstB十聚物在转座酶的存在下能够二聚化。值得注意的是，它们不组装成一个连续的丝，而是以头-头的结构互相作用（标记为1和1’）（图4c）。每个IstB寡聚物的每个最内二聚体的N端结构域与位于相对十聚体的近端AAA+结构域的α螺旋对接（图5a）。有几个氨基酸似乎参与了互相作用，包括Arg84，它与第一个IstB二聚体的两个对称的Tyr35相结合（图5a）。这些氨基酸的突变在整合反应中扰乱IstB诱导的IstA催化的DNA整合（图5b)。这证实了它们结构上的重要性。IS21转座体cryo-EM的重建展现IstB紧紧跟着双链DNA（大约每一IstB二聚物一个DNA弯）来维持为无IstA的复合物描述的总体构象和核酸接触。然而，两个IstB十聚物之间的互相作用也诱导了DNA在它们交点处急剧变形以产生了一个总体上的拐折的S形构象（图5c）。之前有报道表明易于拐折的DNA序列可以作为IS21和其他转座子家族比如IS3的转座热点区域。因此，IstB十聚物交点处的DNA急剧转弯作为靶DNA和被IstA转座酶带到这个复合物的供体DNA之间的接触点 （图5c）。图5 两个IstB寡聚物之间的特异作用和STC中的DNA构象5. IstA β-barrel 促进ATP的水解全转座体结构不仅展示出IstB十聚物之间的未被预料的相互作用，它展现出IstB通过几个接触区域和IstA相互作用（图6a）。IstB的1a和1a’单体的AAA+亚基和转座酶的催化单体相互作用（图6a）。对IstA来说，这个识别是通过灵活地连在转座酶DDE结构域上的C端β-barrel进行的。这些元素对接到一个由IstB的N端二聚化和IstB的C端ATPase形成的外部的深缝隙（图6b）。IstA的Tyr343和Arg345的突变能够严重减弱转座酶激活IstB ATPase活性和被IstB激活促进DNA整合的能力（图6c,d）。IstA的DDE区域也和IstB的1a和1a’ 的AAA+结构相互作用 (图4a,b,e)。放大看IstB活性位点显示与1a和1a'相连的核苷酸的密度和与ATP相连的IstB二聚体活性位点的不同。因此他们除去了转座酶和AAA+寡聚物中灵活的部分并且聚焦精细化全转座体核心。结果显示重建的3.2 Å的与IstA结合的IstB的活性位点的密度和ADP最一致（图6e）。除此之外，在IstA的DDE区域的一个螺旋（205-214AA）和IstB的核苷酸结合口袋之间有大量的互相作用（图6e）。IstA这些位点的突变比如E209A和Y213A能减弱整合活性（图6d）。这些作用看起来能够改变IstB活性位点的构象。值得注意的是IstB的Tyr170能够与其sensor I 氨基酸Asn199相互作用，当IstA结合的时候Tyr170改变了构象（图6e）。之前有提议IstB的Tyr170能够作为一个开关来控制IstB的ATPase活性。与这个提议一致，Y170A突变体维持整合活性但是减少了ATPase活性（图6c,d）。这表明了突变把ATP水解和整合反应分离开了。除此外，IstB中包含sensor II 氨基酸Arg237的α螺旋当IstA结合的时候转离活性位点，构象是通常在ADP结合的AAA+活性位点看到的脱离的结构（图6e）。总的来说，这些结果表明和转座酶相互作用的IstB单体采用了水解后的构象（图6e）。图6 IstA的C端结构域与IstB的相互作用对ATP的水解和DNA整合是重要的6. IstB激活IstA转座酶当IstB存在的时候，转座酶与靶DNA建立了新的相互作用，这包括了DDE结构域的氨基酸如Lys126, Asn188, Lys190 和Tyr 224，它们在上方的单体是暴露于溶剂的（图7a）。这些氨基酸的突变减少了整合活性，这支持了观察到的和靶DNA的接触的重要性（图7b）。他们进一步用无细胞反应检测IstA和靶DNA和在STC中的IstB建立的相互作用的生理功能。IstA和IstB的相互作用也改变了没有IstB状态的IstA四聚体的结构。尤其是在IstA单体的整合位点近端的β-barrels和DDE与IstB ATPase之间形成的新的特异性作用诱导IstA催化亚基一个大规模的72度旋转（图5c）。这个构象的改变能够帮助转座酶的催化氨基酸重新定位来进行转座反应。它也诱导了转座酶上部的单体像剪刀一样张开，破坏在IstB结合之前形成的蛋白蛋白间相互作用，因此创建了一个高度扩展的构象，解开了由IstA稳定的转座前的切割的供体复合物中的供体DNA超螺旋（图7e）。图7 IstA和IstB与靶DNA的互相作用诱导了转座酶大幅构象变化•✦研究讨论✦•重建的全长的IstB的十聚物的AAA+结构域的构象与分离的ATPase的X射线晶体结构显示有一点不同。由于X射线模型中的IstB缺乏调节的结构域和经典AAA+成员的相似性，X射线来源模型可能代表了理论上的活性位点。AAA+寡聚物的弯曲程度被改变来使关键的核苷酸结合的氨基酸错位并抑制ATPase活性。这种改变解释了ATP依赖的调节因子是如何作为分子开关在结合DNA后为催化作准备，然而维持一种自我抑制的构象直到它对应的转座酶结合上来。IstB以U形的通道结合并弯曲靶DNA。值得注意的是，之前已经表明一些系统包括IS21的转座元件靶向S形的DNA。IstB的这种能力可能与局部DNA的灵活性联系，促进插入位点的查找和选择。与此一致，之前研究表明IS21可能更倾向整合到已经被表明易于适应弯曲构象的启动子附近区域。值得注意的是，与IstB相关的IstA转座后状态和噬菌体中转座酶MuA的是相似的，作者因此推测MuA也发生相似的重组过程。总结研究意义IstA对于诱导IstB ATPase 活性是必要的。IstB能够改变靶DNA的构象成S形，IstB与IstA相互作用并改变IstA的构象，从而激活IstA调控转座反应。这个研究阐述了转座反应是如何被ATP依赖的调控因子调控的。参考文献[1] de la Gándara, Á., Spínola-Amilibia, M., Araújo-Bazán, L., Núñez-Ramírez, R., Berger, J.M., Arias-Palomo, E. (2024). Molecular basis for transposase activation by a dedicated AAA+ ATPase. Nature 630, 1003–1011. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07550-6END文案 | Linsey排版 | Linsey审核 | Linsey发布｜姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展

点击上方蓝字，关注我们INTRODUCTION•✦研究介绍✦•研究背景Background非造血细胞（Non-hematopoietic cells）占骨髓细胞总数不到0.5%，其中包括内皮细胞、间充质基质细胞以及成骨细胞却是骨髓微环境的重要组成部分，其被证明对造血具有非常关键的作用。近来单细胞测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术的最新研究进展揭示在小鼠骨髓成分中这些非造血细胞中存在多个亚群。尽管目前对人造血细胞进行了大量研究，但对构成人骨髓微环境的非造血细胞进行定义的类似研究仍然相对较少。其主要的难点在于：难以分离足够的存活的非造血细胞，使得确定骨髓微环境的单细胞组成一直受到限制；特殊的分离方法可能会极大地影响捕获细胞类型的多样性；骨髓抽吸无法捕获紧密粘附在骨骼表面的细胞，并且可能使骨髓 MSC 成分偏向脂肪细胞而非成骨细胞；体外扩增脱离体内的稳态可能会改变间充质基质细胞的转录谱。研究目的Objectives       本研究通过酶消化人新鲜的骨髓组织直接进行单细胞转录组分析，以期克服上述限制。同时采用索引预测抗体进行联合检测以验证分析结果，并采用CODEX图谱以观察MSC-白血病母细胞之间的空间相互作用。CONTENTS•✦研究内容✦•研究亮点1、scRNA-seq 和 CODEX 揭示人类骨髓的组成和空间结构2、人类间充质基质细胞在转录和功能上具有异质性3、成人 HSPC 表现出脂肪细胞周围的空间定位4、CODEX成像揭示急性髓性白血病中MSC的扩增图谱图1 文章示意图RESULTS•✦研究结果✦•1.非造血细胞亚群分析显示 MSC 和 EC 转录多样性间充质细胞之间存在显著的异质性，包括骨谱系（NCAM1、SPP1 和 BGLAP）、脂肪谱系（APOE、LPL、PPARG 和 CEBPA）和成纤维细胞（PDPN、CSPG4、DCN 和 DPT）（图 2A、2B）。研究根据相关基因的显著表达差异性将其分别标记为AdipoMSC、THY1+ MSC、Fibro-MSC、APOD+ MSCs（图 2A 和 2B）。用于细胞治疗26 (ISCT) 的 3 个基因，即 NT5E (CD73)、THY1 (CD90) 和 ENG (CD105)（图 2C）。这三个基因的表达在 MSC 亚群中高度可变，NGFR (CD271) 在亚群中的表达更为一致，这为其继续用作无偏差 MSC 标记提供了理由（图 2C）。样本之间的间充质细胞频率存在相当大的差异，这可能反映了激活等动态细胞状态或采样差异等技术因素。 Fibro-MSC和THY1+MSC在Cyto TRACE中得分最高说明它们是 MSC 亚群中最原始的，具有更高的细胞分化和增殖能力。此外数据还捕获了两类骨髓内皮细胞AEC和SEC。图2 非造血细胞亚群分析显示 MSC 和 EC 转录多样性2.MSCs、ECs 和骨谱系细胞协作产生多种造血支持因子敏感性分析不同类型的 MSC 专门产生特定的支持因子，同时它们也表达显著的相互作用。这些不同亚群MSC细胞分泌的细胞因子对人类HSPC具有重要的支持作用，其中AdipoMSC、THY1+MSC分泌典型的HSPC微环境因子水平最高，它们被造血细胞广泛接受但是对HSPC没有很强的异质性。同时这些细胞因子之间有发生串扰和协调调节的可能性，并且不同的非造血亚群对不同的模块做出了贡献。（图3）图3 MSCs、ECs 和骨谱系细胞协作产生多种造血支持因子3.PCPs能够有效解读非造血细胞在其微环境中的细胞拓扑结构的综合图并靶向特定的细胞器在scRNA-seq数据的指导下采用 CODEX 多重成像联合Mesmer51技术，对803132个细胞进行计算注释，涵盖了12个标本中的32种细胞类型，同时揭示了其蛋白水平表型分布的模式，这些个体之间的总体细胞类型分布相似。本研究还检测到了具有非造血表达谱的骨小梁旁细胞的罕见实例（图4D），我们称之为“骨内膜”。在造血骨界面检测到 Osteo-MSC 和成骨细胞，在骨区域中间主要检测到 Podoplanin+ Fibro-MSC（图 4D、4E）。CODEX 细胞类型的蛋白质表达谱与我们的 scRNA-seq 数据很好地对应，匹配的细胞类型得分非常高，最终的细胞类型注释用于在“细胞表型图”（CPM，图 4F）中可视化细胞拓扑结构。图4 造血细胞在其微环境中的细胞拓扑结构的综合图4.EMP 和 GMP 定位于相对高氧的动脉-骨内微环境造血需要多个生态位的参与，内皮生态位在健康和恶性造血中的具有非常重要的意义。本研究试图利用CODEX和scRNA-seq图谱进一步揭示内皮生态位内的相互作用。结果显示：小动脉细胞出现在骨小梁附近的频率高于随机预期(图5B)，这表明内皮生态位实际上可能与小动脉生态位结合；HIF1A水平在EMP和GMP中很低，这表明这些细胞没有经历缺氧(图5C)，与它们在供氧血管附近的定位有关；更成熟的髓细胞具有高水平的HIF1A，非小动脉区域的EMP具有更高水平的HIF1A，这表明缺氧的空间模式不是由于固有的细胞类型差异(图5D)。同样，EMP在scRNA-seq图谱中具有最低的缺氧特征评分(图5E)。鉴于骨髓是一个广泛的缺氧环境，这一发现表明一个相对含氧的生态位与早期骨髓形成有关，动脉周围壁龛和内皮壁龛可能以某种方式合作，对早期骨髓形成很重要。图5 EMP 和 GMP 定位于相对高氧的动脉-骨内微环境5.CODEX图谱揭示急性髓性白血病的间充质扩增方式及邻域了解骨髓微环境的空间组织对健康的造血和疾病状态具有重要意义。本研究应用骨髓 CODEX 面板探索肿瘤演变和微环境变化，并使用我们的健康图谱作为参考。以阴性淋巴瘤分期骨髓活检 (NSM)作为对照，对用维奈克拉加低甲基化剂 (Ven/HMA) 治疗的髂嵴活检中的三个诊断 (Dx) 和两个配对治疗后 (PostTx) AML 患者样本进行了分析 。研究发现与 NSM 相比，Dx AML 中髓系细胞（不包括成熟髓系细胞）的比例显著增加，（图 6B），Dx 和 PostTx AML 样本的结构发生了明显变化，例如白血病环境中脂肪细胞几乎完全丢失，以及在残留原始细胞的情况下，Tx 30 天后造血功能恢复不完全（图 6C）。AML 中 Adipo 和 THY1+ MSC 的相对频率高 2 到 3 倍（图 6D）。并且鉴定出白血病群体，包括 GATA1+ NPM1c+ 双阳性群体（图 6E）。在各组邻域分析中，Dx AML 标本中，有四个富含母细胞的邻域 - Dx-CN3/CN5/CN9/CN12（图 6G ），其中两个富含 MSC 群体，THY1+ MSC 仅在这些富含母细胞的邻域中显着富集（图 6G）。 Dx-CN9 是一个富含胚泡的邻域，也富含 AEC、骨内膜细胞以及脂肪细胞和 THY1+ MSC，与健康的 EMP 生态位非常相似。两个 PostTx 胚泡富集邻域 (PostTx-CN4/CN14) 类似于 Dx-CN9 和 NSM-早期髓系/小动脉/骨内膜邻域，即动脉-骨内膜早期髓系生态位。该研究还观察到恢复中的 Post-Tx GMP/EMP 邻域不包含 AEC/骨内膜细胞 (PostTx-CN8)，这可能反映了稳态和紧急髓系细胞之间的差异。总体而言，这些数据暗示了标志着造血恢复的保守空间模式。Dx 和 PostTx NPM1 突变母细胞均具有与 GMP 和早期髓系细胞一致的低 HIF1A 水平。PostTx 细胞在治疗后 BCL2 略有下降，线粒体复合物 IV 表达增加。这可能反映了这些 PostTx 细胞对 BCL2 通路的依赖性降低，以及线粒体质量的补偿性增加。图6 CODEX图谱做揭示急性髓性白血病的间充质扩增及邻域SUMMARY•✦研究总结✦•       这项工作代表了一个全面的、空间分辨的、多组学的人类骨髓图谱，将作为未来研究人类骨髓生态位的重要参考。表明了骨髓抽吸物作为样本来源的局限性，更深入地剖析了造血和非造血谱系的细胞分化连续体。其数据提供了 AML-MSC 共定位的体内证据，并表明动脉-骨内膜早期髓系邻域可能在治疗抵抗中发挥作用，不足之处在于需要更多样本才能得出更普遍的结论。参考文献[1] .Bandyopadhyay S, Duffy MP, Ahn KJ, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29. doi:10.1016/j.cell.2024.04.013END文案 | 田慧中排版 | 田慧中审核 | 田慧中发布 | 姜笑南世界生命科学大会RECRUIT关注我们，获取生命科学学界前沿｜促进更多的学术交流与合作业界前沿｜促进更快的产品创新与应用政策前沿｜促进更好的治理实践与发展